甘薯薯瘟病菌RPA检测方法的建立及应用

李华伟, 林志坚, 张 鸿, 刘中华, 李国良, 汤 浩, 邱思鑫

(福建省农业科学院作物研究所/农业部南方薯类科学观测实验站/福建省特色旱作物品种选育工程技术研究中心,福建 福州 350013)

由青枯菌(Ralstoniasolanacearum)引起的甘薯薯瘟病是甘薯生产上一种重要的土传细菌性病害，主要分布在我国的南方甘薯产区(福建、广东、广西、台湾).甘薯薯瘟病能使甘薯减产30%～80%，严重时可达100%，严重威胁甘薯的生产[1-2].发病初期的典型症状是植株出现轻度萎蔫，但整个植株为绿色；发病中后期，甘薯茎秆变为褐色、黑褐色，整个植株萎蔫、死亡.该病与其他甘薯细菌病害(甘薯黑腐病、甘薯茎腐病)症状类似或混合发生,被列为我国检疫性植物病害[3-5].早期诊断对该病的防控尤为重要.

目前，对青枯菌常用的检测方法有平板分离、血清学方法、分子生物学方法等[6-14].平板分离是通过对病原菌进行分离、纯化，并根据菌落形态特征及生理生化特性等对病害进行检测，该方法需配制各种试剂，工作量大且周期长；传统的血清学方法需制备抗血清，技术门槛高且不利于少量样品的检测；PCR和FQ-PCR方法虽然可以快速有效地检测病原物，但需要昂贵的专业仪器，且不适合野外及基层单位应用；FQ-LAMP是一种快速、灵敏、特异和可视化的检测方法，聚合酶(BstDNA polymerase)可在恒温条件下对靶基因扩增，但LAMP在检测过程中会产生气溶胶，易出现假阳性.重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)是英国TwistDx Inc 公司研发的一种核酸等温扩增技术，被认为是可以替代PCR核酸检测的新兴技术[15].近年来，RPA技术已被广泛用于病原菌的检测[16-18]，但还未见利用RPA技术检测甘薯薯瘟病菌的报道.本试验拟建立甘薯薯瘟病菌RPA检测方法，为实现该病的早期快速诊断提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 甘薯薯瘟病菌(R.solanacearumSWRS-1、SWRS-2)、马铃薯青枯菌(R.solanacearumPORS-1)、番茄青枯菌(R.solanacearumTMRS-1)、辣椒青枯菌(R.solanacearumPPRS-1)、茄子青枯菌(R.solanacearumEPRS-1)、烟草青枯菌(R.solanacearumTORS-1)、甘薯黑腐菌(ErwiniacarotovoraspSWX15、SWN15)均由福建省农业科学院作物研究所分离并保存.

1.1.2 主要试剂及仪器 TwistAmpTMbasic Kit RPA 试剂盒(英国TwistDxInc公司)，细菌DNA提取试剂盒(Bacteria Genomic DNA Kit)、2×Es Taq MasterMix(北京全式金生物技术有限公司).金属浴、电泳槽(北京六一生物科技有限公司)，Veriti 96孔梯度PCR仪(AB Applied Biosystems)，超微量分光光度计NanoDrop 2000C(美国赛默飞世尔科技公司)，法国Vilber凝胶成像系统(北京五洲东方有限公司).

1.2 方法

1.2.1 病原菌采集与分离 甘薯薯瘟病样采自福建省农业科学院作物研究所实验基地和福建省福鼎市叠石乡甘薯田.采用TTC平板[TTC培养基：去皮马铃薯200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，牛肉浸膏3 g，琼脂粉15 g，加蒸馏水定容至1 L，pH 7.2，高压灭菌.每100 mL培养基加入400 μL已过滤除菌的1% TTC(2，3，5-氯化三苯四氮唑)溶液]方法分离并纯化病原菌，经纯化的菌株保存于-80 ℃，备用.

1.2.2 病原菌培养及DNA提取 取保存的菌种在TTC平板上划线，28 ℃培养24～48 h，挑取单菌落于NA培养基(蛋白胨5 g、牛肉浸膏3 g、葡萄糖2.5 g，加蒸馏水定容至1 L，pH 7.2)中，28 ℃继续培养18～24 h.使用DNA快速提取试剂盒提取病原菌DNA.

1.2.3 引物设计与合成 根据本实验室前期测得的甘薯薯瘟病菌orf428特异基因序列，依据RPA引物设计原理，设计了2对RPA扩增引物(表1)，引物序列由福州博尚生物有限公司合成.

表1 RPA和PCR检测引物

1.2.4 RPA反应 取模板DNA 2 μL、Rehydration Buffer 29.5 μL、引物F和R各2.4 μL、ddH2O 11.2 μL，将配好的47.5 μL体系加入冻干的重组酶聚合酶中，最后再加入醋酸镁溶液(MgOAc，280 mmol·L-1)2.5 μL，瞬时离心.RPA反应的条件为39 ℃恒温扩增20 min，冰上终止反应.反应结束后，在每个反应管中加入50 μL酚/氯仿(1∶1),10 000 r·min-1离心5 min，留取上清进行琼脂糖凝胶电泳.

1.2.5 普通PCR反应 选用青枯菌特异性引物759F/760R[19]进行普通PCR检测.反应体系：2×Es Taq MasterMix 10 μL，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL.扩增程序：预变性96 ℃，5 min；变性94 ℃，15 s；退火59 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；后延伸72 ℃，10 min.取5 μL产物进行电泳.

1.2.6 RPA特异性检测 分别以2株甘薯薯瘟病菌(SWRS-1、SWRS-2)、5株其他作物青枯菌(PORS-1、TMRS-1、PPRS-1、EPRS-1、TORS-1)和2株甘薯黑腐菌(SWX15、SWN15)的DNA作为模板，以清水为对照，利用RPA反应进行引物特异性检测.

1.2.7 RPA灵敏度检测 使用超微量分光光度计测定甘薯薯瘟病菌DNA浓度，并将其调整为100 ng·μL-1.采用10倍梯度稀释法分别稀释为10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1、1 fg·μL-1，进行灵敏度检测，并与普通PCR做比较.

1.2.8 RPA方法应用 取甘薯薯瘟病菌菌液，以经过沸水浴(10 min)处理和不做任何处理的菌液为模板，进行RPA扩增，检测甘薯薯瘟病菌.

取田间发病组织，剪碎浸泡5～10 min，并用沸水温浴10 min，以经过浸泡处理的菌液为模板，分别用RPA方法和普通PCR方法进行扩增，检测田间病样中的薯瘟病菌.

从本研究室抗薯瘟病鉴定圃中分别随机取土壤和水样3份.土壤样品处理：每5 g土壤加10 mL无菌水，振荡混匀，静置30 min，取上清液，沸水温浴10 min.水体样品处理：取500 μL水样，沸水温浴10 min.以处理的土壤上清液和水样为模板，以薯瘟菌DNA为阳性对照，无菌水为阴性对照，分别用PCR方法和RPA方法检测土壤及水体中的薯瘟病菌.

2 结果与分析

2.1 甘薯薯瘟病症状与病原菌落特征

田间发病植株的地上部叶片萎蔫，剥开茎表皮后能看到维管束变为褐色或黑褐色，发病严重的植株拐头处干枯变黑，植株枯死(图1A-B)；地下部发病轻微的薯块外表无明显症状，但薯蒂处呈水渍状变褐或发黑，横切面可看到褐色或黑色斑点，或连成片，有刺鼻气味，发病严重的薯块整个腐烂，发出刺鼻臭味(图1C-D).在TTC平板上，病原菌落中间呈鲜红色，边缘乳白色，且流动性强，倒置培养时容易沿皿壁向下流动(图1E-F).

2.2 RPA特异性

通过引物筛选试验，筛选出扩增效果较好的一对引物:上游引物F为5′-TTACCAGTTAAAGAATGACCCAAGACATCCAGTG-3′,下游引物R为5′-TCCTATTACAAGAGCAATCAACCAACCTCCAAGA-3′.建立RPA检测体系，对供试菌株的检测结果显示，2株经PCR检测为阳性的甘薯薯瘟病菌的RPA扩增结果为阳性，而其他7株菌和空白对照的扩增结果均为阴性(图2)，说明建立的RPA检测方法特异性较强.

2.3 RPA灵敏度

不同浓度的病原菌DNA经RPA反应后，取5 μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测.结果表明，甘薯薯瘟病菌RPA检测方法的灵敏度可达1 pg·μL-1(图3A)，与普通PCR检测灵敏度相当(图3B).

2.4 甘薯薯瘟病菌菌液检测

以用沸水浴(10 min)处理和不经过沸水浴处理的甘薯薯瘟病菌菌液为模板进行RPA反应，取5 μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测.结果表明，经过沸水浴处理后的菌液能够扩增出特异性条带，而不经过沸水浴处理的菌液不能扩增出特异性条带(图4)，说明RPA能够直接检测经过沸水浴处理后的甘薯薯瘟病菌菌液.

2.5 RPA检测方法的应用

应用建立的RPA检测体系，对采自福建福州、福鼎、三明、泉州、连城的8个甘薯薯瘟病样进行检测，结果均为阳性(图5A)，与PCR鉴定结果(图5B)一致.利用RPA方法对土壤和水样中的薯瘟病菌进行检测，能检测到3个土壤样本和2个水体样本中的薯瘟病菌(图5C)，其结果与PCR检测结果(图5D)相当.这说明建立的RPA方法可靠，能够用于田间样品(薯块、土壤、水体)的薯瘟病菌检测.

3 结论

RPA作为一种新兴的检测技术，已经广泛应用于多种病原菌的检测，如番茄黄化曲叶病毒、番茄细菌性叶斑病菌、马铃薯病毒病等[15,20-22].普通 PCR需经过变性、退火、延伸等3个不同温度阶段进行扩增，而 RPA技术在常温下即可进行等温扩增，检测时间大大缩短[22-23].本研究依据RPA技术原理建立一种甘薯薯瘟病菌的快速检测方法，在39 ℃恒温下只需20 min就能完成目标DNA扩增，其检测结果与普通PCR相当.RPA检测技术对引物的要求比较严格，一般的PCR引物(长度为20 bp左右)不适用于RPA，RPA引物一般需要30～38 bp的碱基.本研究根据甘薯薯瘟病菌特异基因(orf428)设计了RPA引物，并筛选出一对扩增效果好的特异性引物，可检测到2株供试的甘薯薯瘟病菌DNA，而对5株其他作物青枯菌和2株非青枯菌的检测结果为阴性.甘薯薯瘟病菌与其他作物青枯菌在分类地位上同属青枯雷尔氏菌(R.solanacearum)，但青枯菌是一个复杂的菌群，具有丰富的遗传多样性，不同寄主上该菌的生理生化小种不同.此外，本研究建立的RPA检测技术不需要经过病原菌DNA提取过程，只需要将病原菌菌液或病样浸出液置于沸水中处理10 min，即可检测病原菌，进一步缩短了检测时间和成本.总之，本研究建立的甘薯薯瘟病菌RPA检测方法特异性强、灵敏度高(1 pg·μL-1DNA)，且能够用于检测土壤和水体中的甘薯薯瘟病菌.