视网膜相关疾病基因治疗的现状

张道微 张圣海

(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031)

上世纪70代初，科学家曾假设外源性的DNA基因治疗可能是一种有效的治疗遗传性疾病的方法。这种方法在理论上可以通过一次治疗获得持久的临床疗效。尽管从提出概念到临床应用的过程是漫长而曲折，但基因治疗已经给越来越多的医学领域带来新的治疗选择。我们总结了视网膜相关疾病基因治疗的现状，重点关注几种常见疾病的研究内容，并概述了这些新型治疗方法的前景和局限性，以便相关研究人员参考。

1 视网膜疾病的基因治疗进展

几十年来基因治疗因其良好前景受到各领域的关注，相关研究者都希望借此帮助解决治疗效果有限的问题，但由于潜在风险、临床转化困难等原因，一直难以取得突破性进展。直至2017年,第1例基因治疗生物制剂CTL019获得美国食品药品监督管理局(food and drug administration，FDA)批准，用于治疗复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病[1]。

基因治疗能够挽救或维持视网膜结构和功能，有望通过保留和提高患者视力进而改善其生活质量。正在进行的已注册临床研究中针对视网膜疾病基因治疗的有76项，其中43项正处于研究阶段或已在招募患者，19项已经完成，3项正处于注册阶段。43项正在进行的项目中有3项获得了部分安全性和有效性等结果，并已公开发表。现阶段进行干预的研究占比75%，其余多为对已干预患者的长期随访研究，研究范围主要覆盖10种视网膜相关的疾病(表1)，临床一期研究占到全部的一半左右，其余则处于2期或3期阶段。在这些研究中，有37项受试者包含儿童，其中2项仅针对儿童进行。虽然已有研究表明基因治疗中使用载体可能具有包括炎症、全身反应等潜在危害，但病毒载体尤其是腺相关病毒载体仍是目前基因治疗的主要工具。和其他疾病一样，视网膜疾病的基因治疗也主要是通过病毒载体将正常基因、cDNA或其他生物制剂导入视网膜下或玻璃体腔等部位。

2 常见视网膜疾病的基因治疗研究现状

眼所处的位置和解剖学特点使之在基因治疗研究领域优于深部器官，研究者易于操作并能够对眼部症状和疗效获得直观评价，并能避免各种原因对其他组织器官产生的影响。除此之外，由于视网膜下间隙是免疫赦免部位[2]，视网膜及其周围微环境对免疫反应的局部抑制使外周强制表达视网膜抗原性时发生免疫抑制和抗自身免疫[3]，使免疫反应减弱或不发生。加之成熟可靠的操作技术、多样化的检查手段，使眼成为基因治疗研究的理想器官。这里我们选取几种前景良好的视网膜疾病进行讨论，基因治疗将为这些疾病的患者带来新希望。

2.1 Leber先天性黑矇(Leber’s congenital amaurosis，LCA) 2017年Spark Therapeutics公司制造的针对RPE65突变相关LCA的产品Luxturna获得FDA批准，成为第1批基因治疗生物制剂，标志着基因治疗时代的到来[4]。前期研究发现至少存在25个基因突变位点可能造成LCA[5]，临床最常见的类型为编码RPE65视黄醛视觉循环关键酶的基因发生突变，两组同期临床实验研究表明在视网膜下注射携带RPE65互补DNA的重组腺相关病毒，受试者的视敏感度、光敏感度、色觉、光谱敏感度等指标至少在3年内得到显著改善，并在1年时达到高峰。治疗效果与维持视网膜结构的完整性有关，而与年龄无关[6-8]。平行动物实验表明了不同物种间的差异性，人类基因治疗还无法维持长期稳定的状态[7]。在1项1期随访试验中，通过多种测量手段叙述了该项基因增强疗法的综合效益，研究双侧和对侧眼基因治疗的效果，首次确定了对侧眼重复治疗的效果和安全性[9]。另外，有研究[10-11]通过fMRI监测证明受试者在基因治疗后由于视网膜功能的恢复，传入信息引起视皮质的响应和激活在最多3年内维持改善，并作为独立评估基因治疗效果和持久性的补充方法。3期临床试验目前已获批的生物药品 Luxturna用于治疗RPE65相关的LCA，患者需每年行双侧视网膜下注射治疗[12]。

表1 已注册的视网膜疾病基因治疗

CEP290相关LCA是儿童失明常见的遗传类型，这种剪接突变经反寡义核苷酸(antisense oligonucleotides，AONs)的治疗能得到非常显著的效果，通过直接或以病毒载体的方式都能使其转录被纠正[13]。在常见的CEP290突变[14]中使用剪接转换寡核苷酸绕过突变隐蔽外显子，使异常成纤维细胞恢复其纤毛，证明其异常剪接位点可以被纠正[14]。通过断裂内含肽治疗鼠模型，成功通过反式剪接合成完整的CEP290蛋白，能得到显著效果[15]。超过88%的GUCY2D突变会导致特殊的LCA，其编码的鸟苷酸环化酶是光转导途径的关键酶，功能障碍时主要损伤视锥细胞，视杆细胞得以保留[16]。将人GUCY2D用于治疗鼠模型，6个月内保存视锥细胞效果良好，有望用于基因治疗的临床研究[17]。另一种早发型LCA致病基因LCA5的突变导致Lebercilin蛋白功能障碍，严重影响光感受器外段运输。将人LCA5 cDNA注射到LCA5无效小鼠模型中进行基因增强治疗，至少能够部分挽救视网膜结构和视功能[18]。CRB1相关的LCA目前缺乏有效治疗，研究仍处在临床治疗前期[19]。

2.2 视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa, RP) RP是光感受器变性引起视黄酸受体(retinoic acid receptor, RAR)水平增高的致盲性疾病，因此有研究者[20]通过增强RAR的信号转导途径的方式建立小鼠模型，并以基因治疗方式阻断视黄酸信号通路，从而挽救RP。编码环核苷酸门控通道β 1(cyclic nucleotide-gated channel β 1, CNGB1)的基因突变导致常染色体隐性RP, CNGB1-X26小鼠和CNGB1 -/-犬模型与人类RP45有相似的表型[21]，研究者[22]分别通过构建鼠视紫红质启动子调控CNGB1α的基因治疗和人G蛋白偶联受体激酶1启动子调控cCNGB1对2种模型进行基因增强治疗，并通过晚期视网膜成像等测量方法证明了其效果[23]。另一种方式是借助基因编辑技术，在Rho -/-，Rd10和RHO-P347S 3种鼠模型上以CRISPR/Cas9靶向破坏有丝分裂后期视杆细胞的Nrl基因，通过延长正常甚至是功能障碍或形态异常视杆细胞的存活时间，间接提高视紫红质基因突变RP的视锥细胞存活能力[24]。与之类似的是灭活Nrl基因下游与之起到协同作用的转录因子Nr2e3，同样能使视杆细胞获得部分视锥细胞的特性，研究者[25]在Rd10和FVB/N 2种不同RP模型上进行了AAV-gRNA/Cas9治疗，结果显示该基因组编辑方法能有效地将视杆细胞重编程为视锥细胞，进而有效保留光感受器，对于以视杆细胞丢失继发视锥细胞丧失为特点的RP而言，这种治疗方式具有良好的前景。同源独立的靶向整合是基于CRISPR-Cas技术的一项新方法，大鼠模型证明了视网膜下注射对RP的治疗作用[26]，这对基础技术研究和基因治疗都作出了贡献。由于RP致病基因的异质性通常使基因治疗受到限制，而非特异性的基因治疗能对挽救不同亚型的RP作出贡献，靶向抑制Sirt6能将视杆细胞重编程，以增强其糖酵解来延缓RP发展[27]，将基因治疗用于代谢和抗氧化途径能普遍缓解神经退行性疾病带来的危害。目前RP还没有统一的标准治疗方案，但已有部分临床试验正在开展。

2.3 X-连锁视网膜劈裂(X-linked retinoschisis, XLRS) XLRS是由视网膜各层质膜蛋白结合相关的视网膜劈裂[28]基因突变导致的疾病。RS1-KO鼠模型已证明基因增强治疗对光感受器丧失、视网膜损伤和囊肿形成都有积极作用，突触的结构和功能都得到了显著恢复[29]。但在一项前瞻性临床研究[30]中，9名受试者接受了单次单侧玻璃体腔内治疗，病毒载体的免疫原性随剂量升高，其安全性和耐受性不理想。近期有研究者[31]建立了转录激活因子样效应核酸酶携带致病突变(RS1，p.Y65X)的小鼠模型RS1-KI，以期对个体化基因组编辑治疗提供帮助。另有以固体脂质纳米颗粒结合右旋糖苷或透明质酸构建载体，有效通过承载鼠视蛋白驱动子mPOS控制人RS1基因对鼠模型进行治疗，发现有助于鼠视网膜结构改善[32]。

2.4 色盲 色盲主要由视锥细胞编码环核苷酸门控[33]离子通道亚基A3(α亚基)或B3(β亚基)的基因突变导致，其他罕见病因包括GNAT2，PDE6C和PDE6H突变。在CNGA3(-/-)/Nrl(-/-)的鼠模型研究中，证明基因治疗能有效改善视锥细胞功能，同时由于病变主要发生在黄斑中心凹，玻璃体注射还避免了潜在的视网膜损伤[34]，提示玻璃体内注射的方式有望应用于人类黄斑中心凹疾病的安全基因治疗。但另一项基因增强治疗研究中，将红/绿视蛋白启动子用于控制CNGA3基因，经视网膜下注射治疗绵羊，其效果已维持3年以上且没有明显副作用[35]。多个机构从2015年起开始招募受试者进行CNGA3或CNGB3 1期试验，目前这2种主要突变都在临床研究过程中[36]。另外，有研究者[37]发现视锥细胞PDE6α'对其配体PDE6γ'的亲和力高于对视杆细胞PDE6γ的亲和力，PDE6γ'还有利于组装并形成稳定的PDE6全酶，这在研究PDE6α'相关色盲的基因治疗时有重要意义。

2.5 Stargardt病(Stargardt disease, STGD) 最主要的STGD为隐性Stargardt黄斑变性(STGD1)，是由编码ATP结合盒亚家族A成员4(ATP binding cassette subfamily A member 4 , ABCA4)转运蛋白的基因突变引起。目前STGD还不具备标准的临床治疗方法，相关研究人员在1年时间内对27名受试者进行了3次视网膜下治疗，并计划随访15年以评估其长期安全性和疗效[37]。为提高STGD治疗的有效性，各种研究机构正在开展相关的临床前实验，以求得到更好的治疗方案。有研究者[38]尝试通过基因治疗来增加小鼠中最重要的负性调节蛋白CRRY从而挽救STGD1，基因治疗对疾病导致的脂褐素累积和光感受器变性有效，并对同类病因引起的视网膜疾病有提示作用。为建立更良好的疾病模型，对ABCA4基因进行移码插入(c.4176insC)，可获得纯合ABC4蛋白功能丧失的犬，或有助于建立STGD1的大型动物模型[39]。除此之外，针对ABC4大基因优化的双AAV杂合ABCA4载体，能有效增加基因导入的有效性[40]。最新对于大基因的研究通过遗传元件断裂内含肽将多个AAV载体运送的多肽片段拼接为完整的蛋白，进而在鼠模型上实现STGD1的高效治疗[15]。

3 基因治疗的前景和局限

长期以来遗传性视网膜疾病通过传统药物和手术治疗无法取得显著效果，且存在难治愈、治疗手段少、预后差等问题。新兴的基因治疗将重点放在纠正或替代致病基因带来的异常改变上，通过载体稳定导入足量治疗基因或通过基因组编辑技术进行基因置换、基因沉默、基因增强、基因修复等方式来减轻突变基因的危害，有效、安全、经济地整合遗传信息，延长视网膜受累细胞寿命，维持视力[36]。人类基因组计划的完成和基因测序技术的成熟，为基因治疗大范围用于治疗视网膜相关疾病提供了乐观前景。

然而，目前基因治疗仍存在许多挑战，临床前阶段向临床成果转化缓慢，侵入性治疗对视网膜的损伤和相关并发症，长期治疗的耐受性和效果维持，治疗费用昂贵，能否为治疗其他遗传性疾病带来帮助等问题还需要进一步解决。

基因治疗尚处在起步阶段，随着更加深入的研究和发现，越来越多疾病将通过这一极富前景的方法得到解决。