基于环介导等温扩增方法高效检测模拟眼内液中铜绿假单胞菌的研究△

孙杨 荣先芳 卢奕 季樱红

(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 国家卫生健康委员会近视眼重点实验室 中国医学科学院近视眼重点实验 上海市视觉损害与重建重点实验室 上海 200031)

年龄相关性白内障(age-related cataract, ARC)是全球范围内首位致盲眼病，在各种原因导致的视力丧失病例中占一半之多[1]。通过大型流行病学调查发现，在我国≥60岁人群，白内障是双眼(66.8%)和单眼(61.2%)视力损伤的主要原因[2]。白内障迄今尚缺乏有效的治疗药物，手术是目前唯一的有效治疗方式。感染性眼内炎是白内障手术的严重并发症。目前我国大型和中小型眼科机构白内障术后感染性眼内炎的急性发病率分别为0.033%和0.11%[3]。常见致病菌包括凝固酶阴性表面葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌属及革兰阴性杆菌如铜绿假单胞菌等[4]。铜绿假单胞菌是医院感染最常见的病原菌之一[5]，是白内障术后感染主要的革兰阴性致病菌,毒力危害强, 导致暴发性感染；感染发生时极难控制，易造成视力丧失,甚至破坏整个眼球。眼内铜绿假单胞菌早期的快速诊断对治疗白内障术后感染的临床意义重大。传统的临床细菌培养法，诊断周期长，1～7 d，对样本保存条件高，且阳性率不高。而聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)时间较长，扩增产物需要电泳证实，专业设备昂贵，且易污染、假阳性率高，使其应用受到限制。环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification， LAMP)技术只需要一种恒定温度，扩增时间短，仪器简单，是一种快速、准确、低成本的诊断方法。

LAMP技术检测铜绿假单胞菌，目前主要在全身如呼吸道等疾病中应用，在眼部的应用开展极少。本文将应用该技术检测于手术后引起眼内炎的铜绿假单胞菌，建立眼内液中铜绿假单胞菌的快速检测体系。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验所用的菌株见表1。6种菌株来自于中国医学细菌保藏管理中心和ATCC，其中表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肺炎链球菌和蜡样芽胞杆菌用于铜绿假单胞菌引物的特异性筛选。

表1 实验所用菌株

1.1.1 试剂 dNTPs(美国Thermo Fisher公司)；10×ThermoPol Reaction Buffer，Bst DNA 聚合酶大片段(美国NEB公司)；SYBR GREEN I(美国Sigma公司)；硫酸镁(国药集团化学试剂有限公司)。

1.1.2 实验仪器与设备 恒温扩增仪(美国Thermo Fisher公司)；离心机(美国Sigma公司)；UVP Gel Doc-IT凝胶成像系统(美国UVP公司)；Nanodrop 超微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 眼内液的模拟 采用眼内平衡盐溶液(balanced salt solution, BSS)(美国Alcon公司) 0.1～0.2 mL模拟眼内液。

1.2.2 引物设计与筛选 LAMP引物包含F3、B3、FIP、BIP、LF和LB 6条引物。引物设计主要考虑因素包括：引物的Tm值、长度、引物互补片段之间的距离[6]，引物设计主要通过在线网站PrimerExplorerV5设计(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)。我们首先在NCBI上选取铜绿假单胞菌特征性片段，选其中gbca基因中的一段设计LAMP 特异性引物，设计的5组特异性引物分别针对待扩增DNA 的5 个不同对应区域，其中含1 条环状引物LF，2 条外引物F3、B3 以及内引物FIP、BIP。每组引物混合成Mix(F3 5 μmol/L, B3 5 μmol/L，FIP 40 μmol/L，BIP 40 μmol/L,LF 20 μmol/L)，在ABI 7500仪器上以程序63 ℃，1 min，45个循环按照NEB标准LAMP扩增体系(10×ThermoPol reaction buffer 2.5 μL， 10 mmol/L dNTPs 3.5 μL，引物Mix 1 μL，Bst DNA聚合酶大片段 8U，样本1 μL，水补齐至25 μL)进行引物阴性、阳性筛选和BSS病原微生物特异性筛选，最后筛选出一组引物，见表2。

表2 铜绿假单胞菌引物表

1.2.3 细菌核酸提取 将铜绿假单胞菌、表皮葡萄菌、金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肺炎链球菌和蜡样芽孢杆菌标准菌株接种到对应的培养基中，待生长到对数期后，收集菌体，通过QiAmp DNA Mini Kit提取菌株基因组DNA,用Nanodrop 分别进行基因组DNA浓度定量。

1.2.4 实时LAMP体系建立与优化 25 μL LAMP初始体系参考NEB公司建议体系，将上步提取的标准铜绿假单胞菌基因组DNA首先稀释到1 ng/μL 进行初始体系优化，初始反应体系里加入0.1 mol/L镁离子0、1、2、3 μL，优化反应曲线，确定完最佳反应曲线。

1.2.5 LAMP的灵敏度检测 将1.2.3步中提取的基因组DNA倍比稀释到1 ng/μL，100 pg/μL，10 pg/μL，1 pg/μL，100 fg/μL，10 fg/μL，1 fg/μL，100 ag/μL，10 ag/μL，每个浓度梯度下的核酸定量结果重复6次以上，用1.2.4优化的体系进行反应，读取最终检测荧光曲线。

1.2.6 实时荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)验证 用筛选好的LAMP引物的F3和B3进行实时qPCR，使用ThermoFisher 公司SuperScript IV One-Step RT-PCR System进行标准的50 μL反应，检测核酸按照1.2.5的稀释量进行，反应程序为94 ℃ 5 min，再按(94 ℃ 15 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45个循环)，读取最终荧光曲线。

1.2.7 BSS中铜绿假单胞菌灵敏度检测 取培养好的菌悬液，倍比稀释后加入BSS中，稀释成2.1×107、2.1×106、2.1×105、2.1×104、2.1×103、2.1×102、2.1 CFU/mL，用无水乙醇、氨水和石油醚混合液萃取样品，取沉淀物用1.2.3步骤进行菌株基因组DNA提取。

2 结果

2.1 引物的筛选 如图1所示，从5组引物中最终筛选出第3组引物，其阴性扩增不出峰，阳性反应出峰时间在30 min之前。将其和常见5种眼内炎微生物进行交叉扩增，没有出峰，最终确定该组引物可用于后续的灵敏度检测和眼内液中铜绿假单胞菌检测。

图1 铜绿假单胞菌的扩增引物筛选。A、B. 分别为铜绿假单胞菌扩增引物的阴性和阳性筛选；C. 为经A图和B图筛选好的第3组引物的特异性验证。

2.2 实时LAMP体系 镁离子的浓度和Bst酶的活性有着很高的相关性，最适合的镁离子浓度是高效反应的关键。在具体的优化实验中，首先按照标准体系对额外的镁离子浓度为基准进行优化，分别在对应核酸的阴性扩增反应和阳性扩增反应中加入0.1 mol/L硫酸镁0、1、2、3 μL，比较其差别，结果见图2。由图见额外加入1 μL 0.1 mol/L镁离子的量有利于LAMP反应的进行，当额外加入镁离子的量超过1 μL后，阴性对照组的出峰时间也会提前，不利于反应的判断，所以1 μL的0.1 mol/L镁离子是最适加入量。

图2 铜绿假单胞菌LAMP体系优化 A、B. 镁离子分别在阴性反应和阳性反应中的优化。

2.3 LAMP检测铜绿假单胞菌的灵敏度 将铜绿假单胞菌的基因组DNA以优化扩增条件时的核酸浓度向下稀释108倍，结果见图3。从图中可以看出，优化后的LAMP体系(10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 3.5 μL, 引物Mix 1 μL，0.1 mol/L MgSO41 μL，Bst DNA聚合酶大片段 8U，样本1 μL，水补齐至25 μL)可以检测的纯基因组DNA限度在100 fg/μL。

图3 铜绿假单胞菌的LAMP检测灵敏度

2.4 实时qPCR对LAMP检测铜绿假单胞的验证 对铜绿假单胞菌核酸稀释实验，可以发现LAMP方法在铜绿假单胞检测体系的检测限大约是100 fg/μL。为了验证该扩增方法的准确性，我们选择通用的实时qPCR法对上述9个浓度梯度的核酸进行检测，结果如图4，实时qPCR法可以检测1 fg/μL。

图4 实时qPCR灵敏度

2.5 灌注液中铜绿假单胞菌的灵敏度检测 铜绿假单胞菌总共稀释成2.1×107、2.1×106、2.1×105、2.1×104、2.1×103、2.1×102、2.1 CFU/mL 7个浓度梯度，这些浓度梯度菌落稀释液和BSS混合，萃取，提取完基因组核酸后，进行恒温扩增检测，结果如图5，可以看出该体系的检测限可以达到2.1×102CFU/mL。

图5 BSS中铜绿假单胞菌灵敏度检测

3 讨论

正常人的眼周组织如结膜囊、眼睑、睫毛等处以及空气中存在大部分细菌，尤其是表皮葡萄球菌。这些正常菌群在白内障手术时，通过手术器械、灌注液及人工晶状体等进入眼内, 在合适的条件下生长, 导致眼内感染。因此白内障术后眼内炎以表皮葡萄球菌最为常见，属弱致病菌。本课题组曾将LAMP和微流控芯片技术(On Chip)结合应用于超声乳化白内障术毕时前房水的表皮葡萄球菌检测，以传统的细菌培养方法做对照，具有很高的特异度与敏感度[7]。本研究主要采用LAMP管内技术(In tube)，设计了针对铜绿假单胞菌的LAMP引物，和qPCR对比，以摸索铜绿假单胞菌的检测灵敏度。

铜绿假单胞菌并不属于眼部的正常菌群，是呈长棒形的革兰阴性杆菌，与水联系紧密。医院内长期潮湿的地方及湿的物品是其驻扎的场所，从而导致医源性感染。白内障手术相关的铜绿假单胞菌往往来自外源性污染，包括被污染的灌注液、囊膜染色剂、黏弹剂、超声乳化管道等[8-12]。该菌能产生多种与毒力有关的细胞外酶以及毒素，包括弹性蛋白酶、碱性蛋白酶、磷脂酶、卵磷脂酶、细胞毒素、外毒素A、外酶等。其中弹性蛋白酶和碱性蛋白酶可破坏包括纤维蛋白和弹性蛋白组成的角膜或其他组织。而磷脂酶和卵磷脂酶协同作用，分解脂质和卵磷脂，从而破坏整个眼部组织。感染一旦发生，极难控制, 易造成视力丧失,甚至破坏整个眼球，治疗需要争分夺秒。学者[13]报道，1997～2007年收治的71例患者共72眼感染铜绿假单胞菌，最终58眼无光感，占8成。2005年12月11日，安徽省宿州市立医院10例白内障患者在术后发生感染性眼内炎，最终9例被摘除眼球，经我院病原学检测证实为铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)感染[14]。

鉴定铜绿假单胞菌的传统方法有显微镜观察、生化学鉴定和细菌分离培养等，这些技术不仅需要昂贵设备和经验丰富人员，而且过程复杂、操作耗时、阳性率不高。随着基因技术发展，PCR已经成功用于检测铜绿假单胞菌[15]。虽然PCR 在特异度和敏感度上有较大的提高，但是无论普通PCR 还是qPCR都需要通过繁琐的变温程序进行检测, 且普通PCR 后续需要电泳才能观察结果，目前qPCR技术相对更加成熟。

LAMP是Notomi等[16]于2000年公布的技术，其核心是利用4～6条引物，形成具有发卡结构的茎-环元件，然后利用茎-环结构进行扩增，实现对模板的指数扩增。LAMP结果可通过观察扩增管浊度来进行判断[17]，也可以引入非选择性核酸染料如SYBR Green I (SGI)来进行跟踪核酸实时扩增检测的浓度[18]。

LAMP和qPCR、高通量测序(NGS)的异同点如下。①成本费用：包括仪器成本与试剂成本。仪器成本：NGS>>PCR>LAMP，LAMP只要1个温度(65 ℃左右)，相对于qPCR的3个温度循环(94 ℃变性，55 ℃退火，72 ℃延伸)，LAMP扩增仪器的温控更容易实现，仪器更简单、便宜，且易携带，适合于现场检测。试剂成本：NGS建库检测成本>PCR≈LAMP，和qPCR相比，LAMP的引物需要4～6个，且一般较长，引物设计难度高。②扩增时间：NGS>PCR>LAMP，LAMP扩增不需要反复升温、降温过程，快于qPCR的扩增速度。LAMP一般可在30～60 min扩增109～1010倍，而qPCR的扩增速度往往取决于扩增仪器加热和冷却的速率，需要2～3 h。③特异度：LAMP技术一般需要4～6个引物，而qPCR只用2个引物，理论上LAMP的核酸扩增特异度更强。④灵敏度：PCR的检测限和LAMP检测限相仿，具体到不同菌株是不一样的，而NGS需要的起始量一般较高。⑤扩增环境：和qPCR相比，LAMP受临床标本中成分的影响更小, DNA的纯化步骤可以省略[19]。LAMP方法比qPCR方法更快速、简便，目前成为快速检测/现场检测中非常重要的检测方法，广泛用于病原微生物的快速检测和初步筛选[20]。NGS虽然具有检测准确、覆盖全面等优势，但是对人员专业要求高，检测成本较高，临床应用在微生物较少，目前更多用于科研领域。

LAMP引物筛选常易出现假阴性和交叉性，这些都会限制LAMP体系的适应性，甚至导致检测体系的失败[21]。在本研究中，我们首先进行了引物的阴性、阳性和交叉性实验，成功筛选出一组引物，为后续的体系优化和建立提供一个出发点和基础。在LAMP体系的优化中，镁离子是一种很重要的金属离子，它可以调节引物与模板的结合强度，直接影响聚合酶的作用[22]。本反应体系在NEB环介导扩增体系基础上进行镁离子的调试，得出最优化缓冲液，优化后的反应体系可以提高检测的灵敏度。LAMP现在已经有成熟的商业化试剂，但是其显色方法有很多选择，比如SGI、HNB、Calcein、MB等。不同的显色剂，反应条件有所不同。本研究是在SGI显色剂情况下，筛选出特殊的反应成分和引物，在本方案达到反应效率最高，自行配置试剂和筛选引物，引物特异度高，且可根据需要进行灵活条件改变，应用范围更广。本研究建立了一个基于LAMP的铜绿假单胞菌检测体系，检测灵敏度达到100 fg/μL。将铜绿假单胞菌稀释到灌注液中进行倍比稀释，发现可以检出2.1×102CFU/mL，1 h内就可以得出结果，是qPCR所需时间的1/2甚至1/3，尤其适用于快速发展的高毒力细菌的高效检测，并适用于现场检测。

铜绿假单胞菌导致的眼内炎虽然破坏严重，但发病率较低。BSS和房水极其类似，因此本实验采用BSS模拟眼内的房水和玻璃体液，加入铜绿假单胞菌进行条件和方法摸索。另外，我们首先在NCBI上选取铜绿假单胞菌特征性片段，利用gbca基因作为LAMP的目的基因。该基因存在于所有的铜绿假单胞菌中。对gbca基因设计5组LAMP 特异性引物，分别针对待扩增DNA 的5 个不同对应区域，其中第3组引物能特异性地鉴别铜绿假单胞菌，区分于可能引起眼内炎的其他5种细菌，可用于铜绿假单胞菌在眼内液中的检测。

综上所述，本研究应用LAMP检测眼科手术后引起感染性眼内炎的铜绿假单胞菌，在实验中验证了检测的特异度和灵敏度，优化了扩增体系，并且和实时qPCR来进行对照；同时，将铜绿假单胞菌和0.1～0.2 mL BSS制成混合物，检测灌注液中铜绿假单胞菌的灵敏度，设计了检验科可以使用的检测方法，建立了眼内液中铜绿假单胞菌高效、快速的检测方法，具有广泛的临床意义。