甘露聚糖酶和纤维素酶对玉米-小麦-豆粕型日粮的体外消化评价

2020-09-27刘芦鹏王占彬马文锋

家畜生态学报 2020年9期

毛培,刘芦鹏,王占彬,马文锋*

(1.兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州 730020；2.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023)

目前，以植物原料为基础的畜禽日粮中，存在较高含量的非淀粉多糖，如甘露聚糖和纤维素等[1]。这一类多糖经动物采食后可以与食糜中的水分子结合，增加胃肠内容物的黏度，抑制机体对营养物质的利用效率[1-2]。由于单胃动物不能分泌非淀粉多糖酶，因此在畜禽生产中主要通过外源酶的方式进行添加。研究表明，在日粮中添加一些非淀粉多糖酶，如甘露聚糖酶和纤维素酶等，可以破坏植物原料的细胞壁、释放其包裹的营养物质、提高日粮养分与胃肠消化酶的接触面积、专一性的将部分多糖分解为小分子物质，改善肠道消化环境，促进对日粮营养物质的消化吸收[3-5]。

在评价外源酶的作用效果时，可采用动物试验法和体外酶解方法[6-7]。在通过动物试验法进行评价时，可以直观地检测添加酶制剂对动物生长性能的影响。然而，动物试验法周期较长，也需保证相当数量的动物群体才能完成，因此难以评价多种酶制剂的作用效果[8]。近年来研究发现，体外酶解方法可以合理地模拟动物消化环境，同时具备试验周期短、重复性高等诸多优点，可以很好地反映添加酶制剂对日粮营养物质消化率的影响[8]。因此，本试验主要采用体外酶解法，分别以干物质和粗蛋白质酶解率、还原糖生成量为评价指标，研究了甘露聚糖酶和纤维素酶对玉米-小麦-豆粕型日粮营养物质酶解效率的影响。

1 材料与方法

1.1 酶制剂

试验所用甘露聚糖酶和纤维素酶均为单酶，购自河南仰韶生化工程有限公司。酶活性分别为甘露聚糖酶50 000 U/g、纤维素酶10 000 U/g。

1.2 试验设计及日粮组成

本试验采用单因子试验设计方法，每个酶分别设置5个浓度梯度，每个梯度分别设置6个重复，其中甘露聚糖酶的添加浓度分别为5、15、25、35、45 U/g，纤维素酶的添加浓度分别为1、3、5、7、9 U/g。

试验日粮组成及营养见表1。粉碎小麦、豆粕、玉米和麸皮各200 g，过60目筛网后，用四分法分别获得四种原料各50 g、20 g、20 g和10 g，混匀后置于包装袋内密封，备用。当取样时，采用十万分之一天平称取试验日粮样品。

1.3 体外酶解操作过程

准确称取1 g左右的饲料样品(精确至0.0001g)，置于透析袋后编号，置于150 mL三角瓶中，加入20 mL HCl-NaCl缓冲液(0.1 mol/L，pH2.0)和0.1 g的胃蛋白酶(Sigma，P7000)，用封口膜封紧瓶口。在厌氧条件下，将三角瓶置于39℃恒温摇床内振荡6 h，震荡频率为70 r/min。

表1 试验日粮组成和营养成分Table 1 Ingredient composition of the experimental diets

模拟小肠酶解过程：体外消化6 h后，暂停摇床，取出三角瓶打开封口膜，向三角瓶中准确加入20 mL磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.0)和2.5 mL胰蛋白复合酶溶液，在溶液pH 7.0、厌氧环境下，封好三角瓶的瓶口，置于39℃恒温摇床中震荡24 h，震荡频率为70 r/min。

还原糖生成量测定：24 h后取出三角瓶中透析袋，室温静置20 min，吸取1 mL上清液于试管中，加入DNS检测液2 mL，于水浴锅中煮沸5 min，取出，冷却至室温，加入9 mL蒸馏水，混匀。移液枪移取混合液于比色皿中，在540 nm光波处测定各溶液的吸光度值，通过还原糖标准曲线，计算上清液中的还原糖含量。

还原糖生成量(mg/g)=(C×VT)/(m×VS) ×1000

式中：C：标准曲线所查糖量(mg)；VT：提取液的体积(mL)；m：样品的质量(g)；VS：测定时的溶液体积(mL)。

干物质和粗蛋白酶解效率的测定：使用绝干称重的滤纸对三角瓶中的酶解残渣真空抽滤，将抽滤后的残渣和滤纸置于105 ℃烘箱中烘干至恒重，使用半自动定氮仪测定粗蛋白含量。干物质和粗蛋白酶解率的计算公式如下：

干物质酶解率(%)=(M0-M1)/M0×100

粗蛋白质酶解率(%)=(M0×CP0-M1×CP1)/(M0×CP0)×100

式中：M0：饲料样品干物质重量(g)；M1：未酶解残渣干物质重量(g)；CP0：饲料样品粗蛋白含量(%)；CP1：未酶解残渣粗蛋白含量(%)。

1.4 数据分析

以重复为单位，采用SAS(2001)中GLM模型进行数据分析，通过线性(Linear)和二次(Quadratic)效应评估不同浓度甘露聚糖酶和纤维素酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解效率的影响，处理间显著性判定水平为P<0.05，数据平均值以LSMEANS表示。

2 结果与分析

2.1 添加甘露聚糖酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解效率的影响

由表2可知，试验日粮添加甘露聚糖酶时，可以显著提高试验日粮的还原糖生成量(线性和二次，P<0.05)。当甘露聚糖酶添加量分别为25、35 U/g时，还原糖生成量显著高于对照组和5 U/g剂量添加组(P<0.05)。

表2 添加甘露聚糖酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解率的影响Table 2 The effects of mannanase on the reducing sugar production, enzymolysis efficiency of dry matter and crude protein in the diet

由表3可知，随着甘露聚糖酶添加比例的提高，还原糖生成量与甘露聚糖酶含量存在线性和二次方程关系。本试验中关于甘露聚糖酶的最佳添加量由线性方程推导得出，以还原糖为评价指标：该方程为Y=45.07-0.860(20.69-x)，推导得出甘露聚糖酶的最适添加量为20.7 U/g。

表3 甘露聚糖酶添加水平与还原糖生成量的关系Table 3 The correlation between the additional level of mannanase with reducing sugar production

2.2 添加纤维素酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解效率的影响

由表4可知，添加纤维素酶对干物质和粗蛋白酶解率无显著影响，但能显著提高日粮的还原糖生成量(线性和二次，P<0.05)。当纤维素酶的添加量为5、7、9 U/g时，还原糖生成量显著高于其余各组(P<0.05)。

由表5可知，随着日粮中纤维素酶添加比例的提高，还原糖生成量与纤维素酶含量存在线性和二次方程关系。本试验中关于纤维素酶的最佳添加量由线性方程推导得出，以还原糖为评价指标：该方程为Y=51.85-2.625(6.297-x)，推导得出纤维素酶的最适添加量为6.3 U/g。

表4 添加纤维素酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解效率的影响Table 4 The effects of cellulase on the reducing sugar production, enzymolysis efficiency of dry matter and crude protein in the diet

表5 纤维素酶添加水平与还原糖生成量的关系Table 5 The correlation between the additional level of cellulase with reducing sugar production

3 讨论

酶制剂是从动物、微生物或植物中提取的具有生物催化活性的一类蛋白质，分子量较高，具有高效性和专一性的特点，其在适宜的温度、pH等环境条件下具备较高活力，可按实际生产需要进行合理使用[9]。日粮的植物原料结构较为复杂，其所含的多糖类物质难以被动物消化吸收，因此在饲料中通常添加多种非淀粉多糖酶，才能更好的发挥酶制剂的水解作用[10]。然而，非淀粉多糖酶的种类较多，不同种类酶的来源、作用位点和专一性底物也存在差异[11]。

目前，甘露聚糖酶和纤维素酶均已应用于不同领域，如医药、纺织、食品和饲料行业等[12-14]。在豆粕型日粮中甘露聚糖含量较高，添加甘露聚糖酶可以专一性的提高甘露聚糖的利用效率，消除其对动物消化道带来的抗营养作用[14]。研究表明，在蛋鸡或仔猪日粮中添加适宜剂量的甘露聚糖酶，可以提高蛋鸡的产蛋量和平均蛋重[15]，或可以提高仔猪的平均日增重，同时降低仔猪腹泻率[14]。纤维素酶的来源较为广泛，其中微生物源的纤维素酶生产成本较低，应用领域更为广泛[12-13]。在日粮中添加纤维素酶，可以在一定程度上刺激动物机体内源酶的分泌，打破细胞壁结构，使消化酶与饲料中营养物质充分接触，进而改善饲料的养分利用率，同时也可改变纤维多糖的物理结构，进而改变纤维源的系水力，降低肠道内食糜的黏度，降低肠道负担，从而提高动物生长性能[13]。

本试验中，当甘露聚糖酶和纤维素酶的添加浓度分别由5 U/g提高至45 U/g或由1 U/g提高至9 U/g时，可以显著提高日粮还原糖的生成量，然而对粗蛋白质和干物质酶解率无明显影响，相关原因尚不清楚，有待于进一步的研究。这也说明在评价甘露聚糖酶和纤维素酶的体外作用效果时，还原糖生成量指标更为敏感，与酶的添加剂量存在效应关系。也在一定程度上表明，在日粮中添加甘露聚糖酶和纤维素酶时，其发挥作用的主要机制是将大分子糖苷键分解为小分子糖，进而提高营养物质利用率[16-17]。