澳洲鸽子石斛兰花梗芽组织培养技术研究

陈和明 江南 吕复兵 肖文芳 李佐 朱根发

摘  要：以澳洲鸽子石斛兰（Dendrobium kingianum Bidwill）的花梗为外植体，研究花梗芽的诱导、增殖和生根情况。结果表明：在1号诱导培养基[MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%椰子汁（CM）]和2號诱导培养基（MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+10% CM）中均能诱导出芽，尽管在诱导过程中70.6%带节间的花梗茎段因不能诱导出侧芽或侧芽弱小而死亡，但为种苗生产和种质资源的保护提供了一种有效途径。在增殖培养过程中，2号增殖培养基（MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM）有利于增殖培养;在生根壮苗过程中，生根培养基（1/2 MS+NAA 0.3～0.5 mg/L+10% CM）适宜澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡的生根培养。

关键词：澳洲鸽子石斛兰;花梗;组织培养;诱导;增殖;壮苗生根

中图分类号：S682.31      文献标识码：A

Abstract： The induction and proliferation and rooting tests of Dendrobium kingianum Bidwill were studied using pedicel shoots as the explant. The two induction media of MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10% CM and MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+10% CM could induce buds. 70.6% pedicels died without lateral buds induced or lateral buds too weak， but it provided an effective way for seedling production and germplasm resources protection. In the proliferation culture， the medium of MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM was beneficial to proliferation culture. In the rooting and growth culture， the medium of 1/2 MS+NAA 0.3-0.5 mg/L+10% CM was suitable for the rooting culture of D. kingianum ‘Jinsika （DJ）.

Keywords： Dendrobium kingianum Bidwill; pedicel; tissue culture; induction; proliferation; rooting

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.004

澳洲鸽子石斛兰（Dendrobium kingianum Bidwill）是兰科植物石斛属（Dendrobium）澳洲鸽石斛组（Section Dendrocryne）中观赏性较高的原种之一[1]，原产于澳大利亚东部、新加勒多尼亚岛等地[2-3]。其植株长势好、花小且色彩艳丽，抗性较强。当前，国内外对澳洲鸽子石斛兰的组培研究并不多，莫远琪等[1]以澳洲鸽子石斛兰幼嫩假鳞茎为外植体进行了组织培养和快速繁殖研究，Pra?ak等[4-6]利用金属元素和光照等对澳洲鸽子石斛类原球茎的增殖和生长进行了研究，Habiba等[7-8]研究了不同化学物质、植物生长调节剂及不同光源对澳洲鸽子石斛类原球茎生长的影响等。至今，澳洲鸽子石斛兰主要以幼嫩假鳞茎或类原球茎为外植体进行组培快繁，但利用假鳞茎作为外植体容易造成褐化且污染的发生率较高，而利用类原球茎进行繁殖，后代出现变异的几率较大。因此，本研究利用花梗为外植体，研究澳洲鸽子石斛兰花梗芽的诱导、增殖及生根情况，并减少对外植体的伤害及污染率，以期为澳洲鸽子石斛兰种质资源的保存及种苗生产提供技术参考。

1  材料与方法

1.1  材料

澳洲鸽子石斛兰（Dendrobium kingianum Bidwill）开花株由东莞市农业科学研究中心从中国台湾引入，种植于东莞市农业科学研究中心和广东省农业科学院环境园艺研究所的试验温室大棚。在开花期，选取生长健壮的花梗作为外植体，品种编号分别为‘澳0‘澳4‘澳5‘澳11‘澳12‘澳13‘金斯卡。

1.2  方法

1.2.1  外植体的处理  在开花期，选取粗壮、无病害的花梗（图1A），截取长2～3 cm带有节间的花梗茎段（图1B），用自来水冲洗干净，置于超净工作台上用75%的酒精浸泡30 s，然后用0.1% HgCl2溶液灭菌8～10 min，无菌水冲洗5～8次后，用无菌滤纸吸干残余水分并剖去苞片，将其两端各切取0.5 cm，再把花梗茎段接种在诱导培养基上培养。

1.2.2  芽的诱导培养  1号诱导培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%椰子汁（CM），2号诱导培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ AC 1.0 g/L+10% CM。接种50 d后调查出芽的外植体，统计诱导出芽率，诱导出芽率=出芽的外植体数/接种外植体数×100%。

1.2.3  芽的增殖培养  1号增殖培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+AD 2.0 mg/L+10% CM;2号增殖培养基：MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM;3号增殖培养基：MS+6-BA 4.0 mg/L+AD 4.0 mg/L+ 10% CM。将诱导出的芽从芽的基部切下，随机接种到各种增殖培养基中，每处理接种3瓶，每瓶接种4个芽，倘若诱导出的芽数偏少，则增殖时直接接种于2号增殖培养基中进行单株增殖。接种60 d后统计芽的数量，计算芽的增殖倍数。芽的增殖倍数=（培养后的芽数接种芽数）/接种芽数。

1.2.4  生根壮苗培养  1号生根培养基：1/2 MS+ NAA 0.1 mg/L+10% CM;2号生根培养基：1/2 MS+ NAA 0.3 mg/L+10% CM;3号生根培养基：1/2 MS+ NAA 0.5 mg/L+10% CM。将增殖到一定数量的无根苗切下，随机接种到生根培养基中，每处理接种5瓶，每瓶接种10苗。接种60 d后统计生根率。生根率=生根的组培苗数/接种的组培苗数×100%

1.2.5  培养条件  所有培养基均添加3.00%蔗糖和0.70%琼脂，培养基pH 5.8±0.1，培养温度25～28 ℃，光照强度1500～2000 lx，光照时间12 h/d。

2  结果与分析

2.1  澳洲鸽子石斛兰花梗的诱导培养

从表1可看出，大部分带有节间的花梗茎段因不能诱导出侧芽或侧芽弱小而死亡，占了所有接种数的70.6%，说明澳洲鸽子石斛的花梗节间能诱导出芽的效率低。在实验中仅有‘澳0（图2）、‘澳4（图3）和‘金斯卡（图4）分别在1号和2号诱导培养基中诱导出芽，而‘澳5‘澳11‘澳12‘澳13在1号和2号诱导培养基中均未诱导出芽（图5、图6）。

2.2  澳洲鸽子石斛兰芽的增殖培养

2.2.1  ‘澳0‘澳4的增殖培养  由于‘澳0‘澳4诱导出的芽数偏少且为了减少污染，均在2号增殖培养基进行单株增殖培养，其增殖结果见表2、图7和图8。从2表可看出，‘澳0和‘澳4的增殖倍数均为3.0，这表明6-BA和AD有利于澳洲鸽子石斛芽的增殖。

2.2.2  ‘金斯卡的增殖培养  将诱导出的‘金斯卡芽分别接种在1号、2号和3号增殖培养基中，结果见表3和图9。从表3可看出，不同增殖配方对‘金斯卡有显著影响，其中2号和3号培养基之间差异不显著，但2号、3号与1号之间差异显著，说明2号和3号增殖培养基均有利于澳洲鸽子石斛芽的增殖，但高浓度的6-BA和AD对增殖无明显效果。

2.3  澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡的生根培养

澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡生根情况见表4，培养60 d后不同生根培养基对‘金斯卡的生根有影响，其中2号生根培养基和3號生根培养基差异不显著，生根率分别为92.6%和93.2%，说明2号和3号生根培养基有利于澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡生根培养。同时，组培苗‘金斯卡出瓶移栽种植1 a后见图10。

3  讨论

在已报道的兰花组织培养中，利用花梗进行组织培养是蝴蝶兰快速繁殖最有效的方法[9-11]，同时在文心兰[12-13]、树兰[14]和万代兰[15]等方面也有报道，而石斛兰主要采用假鳞茎[1， 4-6， 16-22]和幼嫩叶片[23]为外植体进行组织培养和快速繁殖，但利用花梗进行组培研究的报道较少[24]。本研究采用澳洲鸽子石斛兰花梗侧芽作为外植体进行组培试验，其中有70.6%的花梗茎段因不能诱导出侧芽，或侧芽过于弱小而死亡，仅有‘澳0‘澳4‘金斯卡的花梗侧芽分别在诱导培养基1号和2中诱导出芽，说明澳洲鸽子石斛兰在合适的培养基上能诱导出芽，但效率较低。

在澳洲鸽子石斛兰芽的诱导过程中，6-BA浓度为2.0 mg/L并添加NAA 0.5 mg/L，均能诱导出芽，这与华海霞[25]、李金雨等[26]在蝴蝶兰花梗芽的诱导和李杰等[15]在万代兰花梗芽的诱导方面的研究结果一致，即当6-BA浓度为2.0～3.0 mg/L时，添加少量NAA，芽的诱导效果较好。同时，诱导培养基添加或不添加活性炭对试验影响不大，主要是与花梗分泌酚类化合物较少有关[27]。

从花梗诱导出的芽在增殖培养基中，6-BA和AD均能有效地促进苗的增殖，并获得大量的丛生芽，这与陆顺教等[20]和Martin等[28]在秋石斛新生侧芽增殖，以及杨录军等[29]在蝴蝶兰新品种‘郑农火凤凰的组培快繁的研究结果一致，即影响丛生芽增殖最大的因素是6-BA，其次是AD;莫远琪等[1]也认为6-BA的浓度在2.0～3.0 mg/L时有利于澳洲鸽子石斛兰丛生芽的增殖。但Jonojit等[21]、Sujjaritthurakarn等[22]、Chung等[24]认为不同浓度的TDZ能有效地诱导出类原球茎，同时能进行丛生芽增殖。因此，澳洲鸽子石斛兰芽的增殖还需进一步研究。

生根壮苗在组织培养过程中直接影响组培苗的移栽成活率，NAA对生根具有重要作用。本研究中，0.3～0.5 mg/L NAA有利于澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡生根培养，与陆顺教等[20]和张晓申等[30]的研究结果一致。

4  结论

在澳洲鸽子石斛兰芽的诱导过程中，6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L有利于花梗芽的诱导;在增殖过程中，6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L适合于澳洲鸽子石斛兰芽的增殖，其中由于‘澳0‘澳4‘澳5‘澳11‘澳12‘澳13的外植体数量较少，导致在增殖过程中诱导出的芽数偏少而无法做增殖梯度试验，在接下来的研究中应增加外植体及在获得少量无菌不定芽的基础上，再进行多次继代培养，然后进行更多增殖培养基的筛选和生根实验;而培养基1/2 MS+NAA 0.3～ 0.5 mg/L+10% CM适宜澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡的生根培养。

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