一株植物乳杆菌MMB-03的筛选鉴定及抑菌特性研究

赵永慧 杨杰 朱卿正 郭长明 柴金龙 王淑军 房耀维 盘赛昆

摘要 [目的]从发酵酸鱼中筛选鉴定得到一株产植物乳杆菌素的植物乳杆菌MMB-03，通过研究植物乳杆菌素的酸、温度稳定性及抑菌效果，确定了该植物乳杆菌素的抑菌特性。[方法]采用形态学、生理生化、16S rDNA 分析鉴定该菌株为植物乳杆菌。采用打孔法测定植物乳杆菌素的抑菌效果。[结果]该植物乳杆菌素在pH 4.0～7.0时均有较强的抑菌活性;121 ℃ 处理20 min仍有良好的抑菌活性;对指示菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌等均有良好的抑菌效果。[结论]植物乳杆菌MMB-03在水产饲料和食品保藏方面具有良好的应用前景。

关键词 植物乳杆菌;鉴定;细菌素;理化性质;抑菌

中图分类号 TS 201.3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）17-0189-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.049

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening Identification and Bacteriostasis Characteristics of Lactobacillus plantarum MMB 03

ZHAO Yong hui， YANG Jie， ZHU Qing zheng et al

（Jiangsu Ocean University， Lianyungang， Jiangsu 222061）

Abstract [Objective] A strain of Lactobacillus plantarum MMB 03 was obtained from fermented acid fish. The antibacterial properties of plantaricin from Lactobacillus plantarum MMB 03 were determined by researching acid stability， temperature stablility， and bacteriostatic activity. [Method] The strain was identified as Lactobacillus plantarum by morphology， hysiological and biochemical and 16S rDNA. The bacteriostatic effect of plantaricin was determined by punching. [Result] The plantaricin had strong bacteriostatic activity at pH 4.0-7.0， and had good bacteriostatic activity at 121℃ for 20 min. It also had good bacteriostatic effect on indicator bacteria Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Bacillus cereus. [Conclusion] Lactobacillus plantarum MMB 03 has a good application prospect in aquatic feed and food preservation.

Key words Lactobacillus plantarum;Appraisal;Bacteriocins;Physical and chemical properties;Bacteriostatic

乳酸菌在自然界中廣泛存在，是“公认安全”的微生物，其产物已被允许添加到食品工业中[1-2]。细菌素是由核糖体合成的具有抑菌作用的一类蛋白类物质[3]，已被广泛应用在食品工业、动物生产和医疗以及畜禽饲料等领域[4-5] 。乳酸菌生成的细菌素能够有效抑制食品中的腐败菌，延长食品货架期，可被用作生物保鲜剂[6-7]，如乳酸链球菌素（Nisin）已在食品中大量应用[8-9]。

植物乳杆菌是乳酸菌的一种，常见于肉类、奶类及蔬菜的发酵制品中，是人体胃肠道的益生菌群，具有增强机体免疫力、降低胆固醇、预防心血管疾病和促进营养物质吸收等多种功能[10]。植物乳杆菌来源的细菌素被称为植物乳杆菌素，植物乳杆菌素属于I类或II类细菌素，分子量较小、热稳定性高，可被蛋白酶降解[11]。目前，研究较为深入的植物乳杆菌素有Plantaricin C、Plantaricin EF、Plantaricin JK[12]。有研究者从传统泡菜、果蔬酱、畜禽肠道[13]中筛选得到植物乳杆菌产生的植物乳杆菌素具有良好的抑菌活性。但目前报道的植物乳杆菌素抑菌谱较窄，限制了其在食品工业中的大规模应用。因此，筛选出产广谱抑菌性植物乳杆菌素的植物乳杆菌，对于开发新的防腐抑菌剂具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品。

供试植物乳杆菌采自实验室自制发酵酸鱼。

1.1.2 指示菌。

大肠杆菌（CICC 10003）、金黄色葡萄球菌（CICC 23656）、蜡样芽孢杆菌（CICC 23828）、维氏气单孢菌、嗜水气单孢菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌均来自实验室保藏。

1.1.3 培养基和试剂。

MRS培养基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢铵2 g，七水硫酸镁0.58 g，一水硫酸锰0.19 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 L，pH 6.2～6.4，115 ℃、20 min灭菌备用，固体培养基另加1.5%～2.0%的琼脂。

LB培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0，121 ℃、20 min灭菌备用，固体培养基另加1.5%～2.0%的琼脂。

革兰氏染色试剂盒，杭州百思生物科技有限公司;细菌基因组提取试剂盒，美国Omega公司;过氧化氢酶，美国Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器与设备。

Spx-150B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司;Mastercycler nexus聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪，德国Eppendorf有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集。

用无菌勺子舀取少量酸鱼酸汤，转接至100 mL 已滅菌三角瓶中，标记编号。

1.2.2 乳酸菌MMB-03的分离。

取1 mL样品滤液接种到100 mL MRS培养基中，37 ℃静置培养12 h。取1 mL 富集后的样液梯度稀释至10-6，分别选择10-4、10-5、10-6浓度的稀释液100 μL涂布于含0.3%碳酸钙的MRS固体培养基上，37 ℃静置培养48 h。挑选具有钙溶圈的菌株于MRS固体培养基重复划线分离，得到单菌落后甘油管保藏菌种。

挑取上述分离的纯种菌株接种于MRS培养基中，37 ℃静置培养48 h，发酵液以8 000 r/min离心15 min 后取上清。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌为指示菌，采用打孔法对分离得到的菌株上清液进行产乳酸菌素的筛选[14]。

1.2.3 乳酸菌MMB-03菌种鉴定。

1.2.3.1 乳酸菌MMB-03的生理生化鉴定。

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株MMB-03进行形态观察和生理生化鉴定[15]。

1.2.3.2 16S rRNA的扩增与序列分析。

用细菌基因组快速提取试剂盒提取MMB-03的基因组，进行16S rRNA扩增。PCR扩增引物选择细菌通用引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系为50 μL：dd H2O 38.0 μL，10×buffer 5.0 μL，Mg2+1.0 μL，dNTP 2.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，DNA聚合酶0.5 μL。反应程序：94 ℃ 预变性5 min;94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环;72 ℃终延伸5 min。PCR扩增产物测序，所得序列提交Gen Bank。将该序列与Gen Bank 数据库中的序列进行比对，用MEGA 7.0软件进行16S rRNA序列的比对分析，并构建系统发育树。

1.2.4 抑菌物质的确定。

将菌株以1% 的接种量接种于MRS培养基中，37 ℃静置培养48 h，8 000 r/min离心15 min 后取上清液。上清液体积浓缩1倍后，调节不同pH以排除有机酸的抑菌影响;选用过氧化氢酶处理以排除过氧化氢对抑菌效果的影响;胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后采用打孔法确认抑菌活性，对照选择同样处理的MRS液体培养基，确定发酵产物中的抑菌物质。

1.2.5 植物乳杆菌素的热稳定性。

将植物乳杆菌MMB-03的发酵上清液，分别在4、25、50和100 ℃处理30 min，121 ℃下处理20 min（使用灭菌锅处理），对照选择没有处理的发酵上清液。处理完成后立即进行抑菌试验。

1.2.6 植物乳杆菌素的酸稳定性。

用3 mol/L NaOH 溶液将植物乳杆菌MMB-03的发酵上清液pH调节至4.0、5.0、6.0和7.0，并保持30 min，处理结束后采用打孔法测试抑菌活性。

1.2.7 植物乳杆菌素的抑菌活性验证。

分别以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、维氏气单孢菌、嗜水气单孢菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌为指示菌做抑菌试验，验证该植物乳杆菌素对食品中常见革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

分别以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌为指示菌，采用打孔法对从实验室自制发酵酸鱼中分离得到3株菌的抑菌圈直径进行测定，结果分别为（1000±0.28）、（13.25±0.07）、（10.34±0.37） mm，说明它们均有良好的抑菌效果，挑选其中抑菌性最强的一株作为继续研究的对象，并将该菌株命名为MMB-03。

2.1.1 植物乳杆菌的鉴定。

菌株MMB-03的形态学观察结果见图1。菌株MMB-03为革兰氏阳性菌，菌体短杆状，无鞭毛和芽孢。菌株MMB-03在MRS培养基上培养24 h后，菌落边缘整齐无锯齿状，呈乳白色，表面光滑不透明。

菌株MMB-03的部分生理生化特征结果见表1。由表1可知，菌株MMB-03不能使明胶液化、发酵葡萄糖不产气、接触酶试验呈阴性，能够利用发酵葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、乳糖，但不能利用木糖和阿拉伯糖。

2.1.2 16S测序结果。

利用16S rRNA进行PCR扩增测序，将所得序列与Gen Bank数据库中的序列进行同源性比较，发现与菌株MMB-03相似度较高的菌株均为植物乳杆菌，且相似性达到100%（图2）。因此，将菌株MMB-03鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

2.2 抑菌物質的确定

2.2.1 排酸试验结果。

调节发酵液pH分别为4.0和4.5，对照选择使用乳酸调节至相同pH的MRS液体培养基，抑菌试验验证结果如图3所示。由图3可知，调节发酵液pH至4.0，抑菌活性无明显下降，对照抑菌活性显著下降;调节发酵液pH至4.5，抑菌活性减弱，对照已无抑菌性。说明发酵上清液中含有除乳酸以外的抑菌物质。

2.2.2 排过氧化氢试验结果。

乳酸菌发酵过程中代谢产生的过氧化氢同样具有抑菌作用，过氧化氢酶充分酶解发酵上清液，结果原发酵液、酶处理、对照的抑菌圈直径分别为（1202±0.06）、（11.35±0.04）、0 mm，发酵液经过氧化氢酶处理后，与原发酵液相比，抑菌性无显著性下降，同样处理的MRS培养基对照组则无抑菌性，说明发酵液中抑菌作用不是过氧化氢产生的。

2.2.3 蛋白酶分解试验结果。

分别使用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理发酵液，结果如图4所示。由图4可知，经蛋白酶处理后，发酵液抑菌性显著下降，说明菌株MMB-03产生的抑菌物质可以被蛋白酶部分分解。排除酸和过氧化氢对抑菌效果的影响后，蛋白酶分解上清液，抑菌效果下降，说明发酵液中的抑菌物质为蛋白类物质细菌素。

2.3 植物乳杆菌素的热稳定性

将植物乳杆菌MMB-03的发酵上清液在不同温度下处理一定时间，其抑菌结果如图5所示。由图5可知，不同温度处理后，其抑菌性无显著性差异。121 ℃处理20 min后，与对照相比，抑菌性无明显下降。说明该植物乳杆菌素的热稳定性较好，一般的热加工对其抑菌性影响不大。

2.4 植物乳杆菌素的酸稳定性

由图6可知，随着pH的逐渐升高，菌株MMB-03发酵上清液的抑菌性逐渐下降，在pH中性条件下，菌株MMB-03发酵上清液仍有良好的抑菌性，说明菌株MMB-03发酵上清液具有良好的酸稳定性。

2.5 抑菌活性验证

以食品中常见的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌为指示菌进行抑菌试验，研究MMB-03的抑菌活性，结果如图7所示。由图7可知，MMB-03的发酵产物对食品中常见的革兰氏阳性、阴性菌具有良好的抑菌效果。

3 讨论

生物防腐剂替代化学防腐剂成为食品防腐研究的趋势。细菌素Nisin等虽然已经被大量应用到食品中，但Nisin抗菌谱较窄，仅对革兰氏阳性菌有很好的抑制效果;纳他霉素则能够有效抑制和杀死酵母菌和霉菌[16]。杨煌建等[17]从链霉菌FIM-0916的代谢产物中分离得到具有抗菌活性的环脂肽化合物0916A，其对革兰氏阳性菌具有很好的抑制作用。因此，开发研究具有广谱抑菌效果的生物源防腐剂具有重要意义。

目前，发酵食品已经成为筛选植物乳杆菌的重要来源[18-19]，也有研究者从鸡鸭粪便[20-21]、畜禽肠道[13]中筛选到植物乳杆菌。该研究是从自制可食用酸鱼中筛选出植物乳杆菌，菌株来源安全卫生。目前发现的植物乳杆菌素抑菌谱较窄，应用局限性大。葛菁萍等[22]从酸菜中分离得到一株植物乳杆菌产细菌素paracin，其仅能够抑制沙门氏菌、大肠杆菌等病原菌。plantaricin 35d[23]和ST28MS[24]对大肠杆菌没有抑制作用。Bac TN365对革兰氏阴性菌和霉菌有抑菌效果[25]。该研究发现的植物乳杆菌素可以有效抑制食品中常见的革兰氏阳性、阴性菌，抑菌范围更广。高鹏[14]研究的细菌素虽然有广谱的抑菌作用，但其在90 ℃ 处理10 min后，细菌素的抑菌性急剧下降;处理30 min后细菌素已无抑菌性。而该研究发现的植物乳杆菌素在121 ℃处理20 min后抑菌性没有显著变化，具有良好的热稳定性。

4 结论

该研究从实验室自制酸鱼中筛选得到1株具有较强抑菌活性的菌株，通过对该菌株进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定，确认该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），根据其编号命名为Lactobacillus plantarum MMB-03，并确定了Lactobacillus plantarum MMB-03的系统发育关系。通过排除有机酸、过氧化氢，并且经过胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后，确定Lactobacillus plantarum MMB-03可产细菌素。分析表明，该植物乳杆菌素具有良好的热稳定性，抑菌性受酸影响小，能够有效抑制食品中常见的革兰氏阳性、阴性菌。该研究为开发新型天然防腐剂奠定了理论基础。

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