草莓病毒病、脱毒技术及病毒检测研究进展

2020-09-26霍辰思樊新萍刘伟

山西果树 2020年4期

关键词：病毒检测

霍辰思樊新萍刘伟

摘要：针对草莓主要病毒病及其为害特点、草莓脱毒主要技术及病毒检测技术进行综述，介绍了近年来草莓脱毒苗繁育技术，以期对草莓生产提供理论指导作用。

关键词：草莓病毒病;脱毒技术;病毒检测

文章编号：2096-8108（2020）04-0066-06 中图分类号：S668.4 文献标识码：A

Research Advance in Detoxification Technique and Virus Detection of Strawberry Virus Disease

HUO Chensi， FAN Xinping， LIU Wei

（Fruit Tree Research Institute of Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， China）

Abstract： The injurious characteristics of strawberry virus disease、main technologies of strawberry detoxification and virus detection techniques were summarized in this research. The breeding technique of virus-free strawberry was introduced，in order to provide theoretical guidance of strawberry production.

Keywords： strawberry virus disease; detoxification technology; virus detection

草莓（Rosaceae，Fragaria）在园艺学上属浆果类果树，多年生蔷薇科草本植物[1]。其资源类型多样，适应强，栽培面积广，是一种重要的经济作物。果肉香甜多汁，含有大量微量元素和维生素，营养价值极高，素有“水果皇后”之美称，是一种深受大众喜爱的水果。多以无性繁殖为主，其繁殖方式有匍匐茎繁殖、新茎分株繁殖和离体繁殖。然而，通过传统繁殖方法并不能有效脱除病毒。很多农业企业只注重产量，对生产中出现的病毒病并没有得到有效重视。由于多年连作，种性退化严重，草莓病毒病严重影响产量。其主要表現为植株生长缓慢、叶片皱缩见斑驳、果实畸形品质变差[2]。目前，草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓镶脉病毒、草莓皱缩病毒和草莓潜隐环斑病毒是栽培生产上广泛侵染草莓的几种病毒[53]。

草莓同马铃薯、甘薯、山药等无性繁殖植物一样，一旦感染病毒就会传染给后代。随着无性繁殖系数不断扩大，病毒传播速度也逐渐加快。草毒植株本身对病毒并没有免疫能力，目前尚没有特效方法或外用药剂可以治愈病毒病，获得草莓无病毒苗的有效方法仍是通过组培脱毒，得到无病毒原种植株，然后将无病毒苗进行扩繁，从而达到满足市场的需求量[4]。目前，在草莓病毒脱除方面，热处理结合茎尖培养脱毒法国内外普遍采用的一种方法[5-6]，但这种方法存在操作时技术难度大、培养周期耗时长、脱毒环境要求高、脱毒苗成活率低等问题。本文通过对草莓病毒病的研究现状、脱毒技术及病毒检测鉴定等方面的研究进行综述，以期对草莓生产起到指导作用。

1 草莓主要病毒病类型

1.1 草莓斑驳病毒（strawberry mottle virus， SMoV）

草莓斑驳病毒又叫草莓轻型皱缩病毒，属伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、（Sadwavirus）病毒属[2]。病毒粒子形状为球形，通常存在于植株叶片的表层、韧皮部以及薄壁细胞里。1938年，第1次在英格兰凤梨草莓上发现该病毒，存在范畴广。该病毒属典型的半持久类蚜虫传染，其传播途径以草莓钉毛蚜为主，托马斯毛管蚜、花毛管蚜、棉蚜等蚜虫皆可传播。通过嫁接和机械接种进行传染;不能通过草莓种子传染，植株间相互触碰也不会被传染。感染该病毒草莓的主要症状为：叶脉透明水渍化、脉序杂乱，叶片褪绿见斑驳，植株矮化;病症随季节变化其表现略有不同或无症状，但随着侵染时间延长，也会导致植株生长势减弱，产量降低。

1.2 草莓镶脉病毒（strawberry vein band virus， SVBV）

草莓镶脉病毒属花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）、花椰菜病毒属（Caulimovirus）[2]。病毒粒子体积较大，呈球型，没有包膜。通常于细胞质里进行复制，依附于叶片表面、植株表皮、跟木质部连接的维管束以及细胞质。英国科学家于1952年从美国、巴西等地引进的草莓品种Fairfax上首次发现该病毒，随后在全球范围广泛传播。它属于半持久性蚜传病毒，同草莓斑驳病毒类似，主要通过草莓钉毛蚜进行传播;鉴于其在传播媒介里不能进行复制，所以无法通过汁液传染，也不能通过种子及花粉传染。研究发现：弗吉尼亚草莓、丛林草莓、智利草莓等被该病毒侵染后植株症状为叶脉发黄、叶片边缘呈不规则黄色、新叶细弱畸形等。由于该病毒来源复杂，不同地域坏境下SVBV基因组分子存在差异，这也导致危害特点、传播媒介各不相同。

1.3 草莓皱缩病毒（strawberry crinkle virus，SCV）

草莓皱缩病毒属弹状病毒科（Rhabdoviridae），细胞质弹状病毒属（Cytorhabdovirus）[2]。病毒学家普遍认为草莓潜 A 和潜 B 病毒与SCV 同属一类病毒。现如今，大范畴存在于国内外，还有着株系分化的情况。病毒粒子形状呈子弹状，通常依附在植株表皮、导管跟筛管周围的软体组织细胞里。该病毒的传播媒介通常是草莓钉毛蚜，传染性持久，可以在昆虫的体内完成复制，还可以通过接种及嫁接的形式传播;植株彼此触碰不会发生传染，种子跟花粉同样不会传播病毒。在生产上主要危害丛林草莓，受其侵染后，花瓣变形缺瓣，植株叶片畸形，叶脉边缘出现大面积不规则褪绿斑及坏死斑，叶脉由绿色变为水渍透明状，幼叶生长大小不均，皱缩扭曲，小叶黄化，植株矮化、果实畸形，严重制约草莓产量。

1.4 草莓潜环斑病毒（strawberry latent ringspot virus， SLRSV）

草莓潜环斑病毒属豇豆花叶病毒科（Secoviridae），线虫传多面体病毒属（Nepovirus）[2]。通常存在于欧洲、美国及俄罗斯等国家，中国目前尚未发现该病毒。病毒粒子形状尚不确定，有文献报道其粒子形态为球型。主要以长剑线虫为媒介传播。主要感染种球、苗木以及块茎。植株受到病毒侵染后，主要表现为叶片畸形、褪绿黄化;植株矮小、果实品质下降，危害严重时可绝产。

1.5 草莓轻型黄边病毒（strawberry mild yellow edge virus，SMYEV）

草莓轻型黄边病毒属甲型线性病毒科（Alphaflexiviridae）、暂定为马铃薯Χ病毒属（Potexvirus）[2]。苏代发[2]在文献中阐述，在1992年时，这种病毒首次发现于美国加州，之后澳大利亚、欧洲和日本等地相继发现此病毒，现如今在国内外广泛传播。病毒粒子呈线性，属单链正义RNA。

该病毒传播媒介通常是草莓钉毛蚜，不能在其他传播媒介中繁殖。这种病毒单独侵染危害小，通常是跟其他多种病毒共同侵袭植株。受病毒复合侵染后表现：嫩叶绿色褪除出现黄色斑点，老叶出现坏死条斑，叶片大面积枯死，植株变矮，果实畸形、果品变差，极大程度影响草莓产量。

2 草莓脱毒技术

2.1 草莓茎尖培养脱毒

植物茎尖分生组织由不断分裂的细胞组成，由于其生长旺盛、细胞分裂快，且在1.0 mm范围内受病毒浸染小。因此，生產上广泛使用的方法仍是草莓茎尖脱毒[13]。Belkengren and Miller最早应用组培法获得了草莓无病毒苗，法国学者Morel[14]证明已感染病毒的植株通过茎尖分生组织培养，可以恢复成无病毒植株。茎尖大小直接影响着脱毒效果，由于病毒广泛存在于无维管束的分生区域内，需依靠胞间连丝进行传递，茎尖分生区域的细胞分裂、生长速度较快，病毒的传递速度较茎尖分生细胞慢，所以生长点病毒含量最低[15]。然而，组培中剥取茎尖大小直接影响其脱毒率，茎尖越小脱毒率越高，而成活率却有所降低，且剥取范围越小操作难度越大。因此，掌握合适的剥取范围对脱毒率和成活率至关重要。沈磊、童尧明[51]等切取草莓茎尖分生组织0.2～0.4 mm进行组培，出苗率为83%～90%，脱毒率高达100%。高山林[16]把切取的草莓芽冲洗后，通过高温、短时间快速热处理，用茎尖培养法获得无病毒草莓苗。高遐虹[17]在试验中采用二次脱毒方法：即第1次不剥离茎芽的苞叶，直接切割茎尖进行组培脱毒，将培养2个月后的组培苗从瓶中取出，再次切取0.4～0.6 mm的茎尖进行第2次脱毒培养，获得分化率和脱毒率分别为79.2%和84.5%的草莓脱毒苗。何欢乐[18]等研究表明：取大约0.5 mm茎尖进行二次脱毒培养，脱毒率高达100%，但成活率却大大降低为26%。综合前期研究表明，采用茎尖脱毒，茎尖大小通常控制在0.2～0.4 mm左右，脱毒率最高。若热处理时间过长，会阻碍茎尖正常生长，导致存活率下降。综上所述，传统茎尖培养及二次脱毒茎尖培养技术虽是获得无毒苗的有效手段，但存在操作复杂耗时长、工作效率低的问题。因此，摸索出一套高效、快捷、简便的脱毒方法至关重要。

2.2 热处理脱病毒

自然界大多数的病毒粒子都有不耐高温特性，热处理脱毒就是利用高温能使病毒粒子失活，达到灭活效果[21]。热处理包括热水处理和热气处理，目前脱毒效果较好的方法是利用恒温或变温的热空气处理带病植株，剪取热处理后长出的新芽进行嫁接或进行组织培养，得到无病毒的草莓原种植株。肖君泽[19]通过37～38 ℃恒温或35～38 ℃变温处理草莓茎尖，有效降低热处理后植株死亡率。廖俊杰[20]等将育苗钵培养的草莓苗于38 ℃恒温箱处理15 d后并没有脱除病毒，处理90 d后脱毒率仅为66%。刘健[21]在文献中表述茎尖在 40 ℃与42 ℃水浴处理的脱毒率均可达100%，综合考虑成活率与脱毒率，热处理温度以40 ℃为好。

2.3 化学试剂脱毒

化学疗法脱毒就是利用化学试剂在植物体内可以延迟或是抑制病毒复制，从而使植物摆脱病毒的一种外界干预法。该方法对茎尖大小要求不高，无需特定范围的茎尖也能得到较好的脱毒效果。对于化学药剂处理脱毒的机制尚未有很深入的研究，目前植物脱毒的化学试剂主要有三氮唑核苷（病毒唑）、5-二氢尿嘧啶（DHT）、放线菌素、碱性孔雀绿及环乙酰胺等，其中病毒唑是应用最广的化学试剂。1953-1954年，D.Norris最早将孔雀绿用于马铃薯无病毒苗培育，脱掉了马铃薯X病毒，获得了马铃薯无病毒苗。廖俊杰[20]等采用培养基化学疗法和田间化学疗法进行对比试验，在培养基中加入化学试剂后切取适当茎尖进行组培，获得比对照（田间化学疗法）高70%的脱病毒率。秦梅[22]在甘薯脱毒培养基中加入10 mg/L的三氮唑核苷后，脱毒率可达到76%。Cassells[23]等将病毒唑加入培养基中，通过组培可脱除马铃薯多种病毒。通过化学疗法虽然能得到脱病毒植株，但是会有轻度药害现象发生。有研究表明其毒性会遗留在新生植株内，随后进入人体，与现在提倡的绿色环保无公害作物相驳。出于安全实效性考虑，很难在生产中推广应用。

2.4 热处理与茎尖培养相结合脱毒

利用传统的热处理脱毒，由于茎尖在高温、高湿环境下处理时间过长，植株易枯死、容易受红蜘蛛、蚜虫等昆虫危害。且不同病毒对高温的耐受性不同，单纯依靠热处理并不能有效脱除病毒。而热处理与茎尖培养相结合比常规脱毒效果更好，目前该技术在生产上普遍使用。王际轩[24]将生长旺盛的草莓盆栽苗于38～40 ℃温度下热处理42 d，选取热处理后大小合适的茎尖进行组织培养，脱毒率能达到70%左右。何欢乐[46]在草莓茎尖培养脱毒效果研究中采用改良热处理茎尖培养法，先将草莓匍匐茎于40 ℃水浴处理4 h后，剥取 0.5～0.6 mm左右的茎尖进行培养，获得47.37%茎尖成活率。刘健[21]在试验中设计40 ℃和42 ℃两个温度梯度，处理后的茎尖脱毒率均可达到100%，但鉴于时间长短对茎尖有影响力，一般采用40 ℃处理4h为宜。李志强[25]等以草莓品种“红颜”、“章姬”为试材，筛选出茎尖诱导培养最佳培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L，并建立其组培快繁体系。顾地周[26]采用均匀设计法，将已感染了斑驳病毒和皱缩病毒的草莓试管苗在试管内诱导匍匐茎，再将带有匍匐茎的试管苗直接进行56 ℃高温处理后，切取1 mm的茎尖在LS+6-BA 1.00 mg/L+GA3 1.90 mg/L+KT 1.00 mg/L培养基进行培养，通过病毒检测和栽培观察可知，脱毒率高达100%。

2.5 超低温脱毒

超低温脱毒是一种新型高效脱毒技术，较传统脱毒法而言，其脱毒效率更高，且对茎尖大小无要求。超低温冷冻疗法是兼植物种质资源保护与脱毒双重作用的一种脱毒方法，其作用原理是[27]：利用茎尖分生组织细胞与分化细胞结构上的差异进行脱毒。由于茎尖分生组织细胞体积较小、液泡小和较大核质体积比等特点，脱水更容易，在液氮环境中不易被冻死;而茎尖分化细胞体积较大，含有较大的液泡和较小的核质比，脱水处理较难，在超低温环境下易被冻死。此外，茎尖分生组织病毒含量少，而分化组织往往是病毒富集区。因此，当液氮处理分生组织后，受伤死亡的细胞大部分都是分化细胞，而保留下来的不含病毒分生组织，可通过组织培养获得无病毒植株[27]。Brison等（1997）首次运用超低温脱毒法脱除李痘包病毒（Plum pox virus，PPV），获得李无病毒植株。此后，超低温冷冻疗法开始普遍应用于植物脱毒。目前，超低温脱毒技术已经在百合[28]、甘薯[29]、马铃薯[30]、黄瓜[31]、葡萄[29]、柑橘[32-33]、香蕉[31]、樱桃[34]、猕猴桃[35]等植物脱除病毒上广泛应用，对于草莓研究报到较少。罗娅[37]优化超低温脱除体系，草莓的茎尖存活率为69%，多种草莓病毒被脱除，脱除率高达100%。盛宏亚[38]以携带草莓斑驳病毒（SMoV）“红颜”为供试材料，建立预防“红颜”草莓的茎尖玻璃化超低温脱毒体系。利用RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒的脱毒效果，脱毒率为100%。陳曦[39]以“福莓1号”为试材，利用茎尖超低温冷冻脱毒技术将外植体低温锻炼2周后，茎尖在预培养基上暗培养 3 d，1/2浓度 PVS2溶液及全浓度PVS2溶液冰上冷处理2次，液氮冷冻 1 h后，在39 ℃的水浴中快速化冻2 min，卸载后茎尖先暗培养3 d后转入正常光照培养，再生培养成活率约30%，病毒脱除率为100%。

3 草莓无病毒苗鉴定与繁殖

3.1 草莓病毒病检测方法

采用上述脱毒技术获得的草莓苗并不一定能够完全脱毒，因此需要对脱毒后的草莓苗进行病毒检测。无病毒苗的鉴定主要有生物学鉴定、血清学检测法、电镜检测法等[47]。目前，分子PCR 技术也被广泛应用到草莓病毒检测中[40]。生物学鉴定法又称指示植物检测法，是最早应用于植物病毒检测的方法，目前仍被广泛应用[47]。该检测方法可以直接观察到检测结果，无需特定仪器设备，操作简单易掌握。不过检测时间耗时长，受外界环境因素影响大，容易出现检测结果的假阳性，降低其检测的灵敏度[48]。血清学病毒检测法应用较早，该方法利用抗原与抗体的特异性反应，来鉴定植物是否携带病毒[49]。常见的血清学检测方法有沉淀反应、凝聚反应（VBA）、酶联免疫的吸附法（ELISA）、免疫荧光技术（IFA）、斑点免疫测定法（DIBA）以及免疫胶体金技术（GICT）[49]等，这些方法具有较高的检测灵敏性，能够快速的检测到草莓病毒，操作也相对简易方便。但由于其检测时常依赖血清的品质，可被鉴定的病毒种类受到限制。目前仅有少部分果树病毒的抗血清可被利用，草莓病毒检测中，只有草莓轻型黄斑病毒和草莓皱缩病毒抗血清制备成功[50]。电子显微镜技术在生物学、细胞学、病毒学等多个生命科学领域发挥重要作用，不仅能够直观、准确的观察到植物表面特征，还可以对病毒机理进行深入的内在挖掘。由于设备价格昂贵，对实验人员操作技术要求高，并没有广泛应用到植物检测实际工作中。但电子显微技术作为辅助检测技术，在分子生物学领域发挥着不可磨灭的作用[41]。分子生物学检测法以核酸分子杂交为基础，成为当前病毒检测最主要方法。因其检测时灵敏度高、特异性强，不受季节、外界环境影响，采样后可随时进行大批量检测，发挥着血清学检测法及传统病毒检测法无法比拟的优势。目前，反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法、以RNA分子转录为基础的NASBA检测法、核酸杂交技术和基因芯片技术等是分子生物学检测的常用手段[3]。

3.2 草莓脱毒苗繁育技术

草莓脱毒苗较传统繁殖方式有较大优势，其在植物学性状、果实品质、丰产性等各项指标均优于普通繁殖苗。大量研究表明，栽培无病毒的草莓苗，能够提高草莓的质量。草莓果实着色正常，果形整齐，畸形果率降低[19]。这些都为草莓优质、商品化生产提供有力保障。在现代化草莓种苗扩繁基地，脱毒苗的组织培养为种苗生产发挥关键性作用[52]。在脱毒快繁过程中不仅要提高组培苗的增殖率和成活率，还要求对培养基浓度、培养容器种类及凝固剂种类等进行优化筛选，在保证种苗生产质量的基础上达到降低生产成本，找到节能、环保、高效的繁育技术。张恒[42]等用蛭石 + IBA 溶液作为草莓大苗沙盘生根培养基，利用保鲜膜对沙盘进行保湿，可保障草莓继代培养的大苗在沙盘里生根。将该技术应用于草莓脱毒苗的扩繁，可节约大量成本。谢文申[43]以脱毒野薄荷试管苗为外植体，用30 g/L食用白糖代替蔗糖、用凉开水代替蒸馏水配置浅层液体培养基，比普通固体培养基节约成本 57.44%。张春芬[44]为降低草莓脱毒组培苗的生产成本，用白砂糖替换蔗糖、卡拉胶替换琼脂粉，总成本降为原来的 32.5%。采用带塑料瓶盖的玻璃瓶，可大大节省劳动力，提高生产效率。另外，随着生物技术发展，脱毒草莓苗的培育更倾向于集生物工程、病毒学检测和快繁农艺技术为一体的栽培模式，应将这一高新技术系统化、高效化、实用化的应用到草莓生产中。

4 展望

近年来，随着绿色生态种植农业的蓬勃发展，草莓种植面积逐年增加。由于其生长周期短、采摘方便，草莓生态园自助采摘模式已成为深受市场青睐的一项新型产业。脱毒草莓苗在生产上的应用，极大提高了种植者积极性。而草莓病毒病严重制约草莓高产优质进程，重茬种植造成草莓品种单一、种性退化。为了满足市场上草莓周年供应，建立完善的种苗繁育体系、标准化草莓病毒检测中心[40]，从源头上管控草莓病毒，引进脱毒成功的草莓品种尤为重要。由于草莓病毒病多为复合型病毒感染，单一应用传统的脱毒方法并不能达到良好的脱毒效果，生产上应该采取多种脱毒方法混合使用。随着基因工程的发展，生物技术的广泛应用为草莓脱毒及无病毒苗鉴定开辟了新的途径。目前，草莓脱毒苗繁育体系虽然有了一定的发展，但是组培快繁技术成本高、操作环节严谨难度大、资源浪费严重，需进一步探索符合生产实际、节能环保高效的繁育体系，促进草莓业健康发展。

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