腐殖土与解磷微生物协同改良碱性土壤有效磷的研究

祁 彧，张艳荣，张 弛，张卫珂

（太原理工大学 环境科学与工程学院，太原030024）

磷是植物生长所必需的营养元素之一。土壤磷以无机态和有机态存在，其中有效磷占土壤全磷量的25%～70%左右［1］。随着常规磷肥的盲目使用、水土流失及磷酸盐类自身化学转化，大量磷素以无效态储存，并带来了农业的面源污染、水体的富营养化及改变土壤生物多样性等问题［2-3］。因此，寻求改良土壤中有效磷的途径和方法，对农业生产的可持续发展和生态环境问题的改善具有重要意义。磷在碱性土壤中的转化过程以吸附-解吸为主，其影响因素主要有pH值、钙、铁铝氧化物、有机质等［4］。首先，碱性土壤中因含有大量的HCO-3而具有较高的pH值，并具有较大的缓冲性，对磷的固定能力很强［5］，土壤pH接近中性时，磷的有效性才能达到最高［6］。已有研究表明低分子量有机酸、酸性物质（磷酸二氢铵、硫磺等）和生物酸性肥料均可通过改变土壤的pH值，对土壤养分有效性产生影响［7-9］。此外，通过施用有机肥料也可促进土壤有效磷含量的提高［10-11］。研究证实，腐殖土可提供大量有机质（以腐殖酸为主），能改善土壤基质的疏松度、提高孔隙度，有利于根系扩展，还能为微生物活动提供碳源［12］。目前市场中生物磷肥占比较少，溶磷微生物种类繁多，菌种获得的难易程度不一［9］，与有机肥料混合施用方面鲜有报道。基于此，本文根据醋酸杆菌具有耐高温、耐乙醇、高产酸（乙酸），且已在发酵等行业广泛应用等特点［13］，将其作为解磷菌种与腐殖土共同施入碱性土壤，通过土培试验对比分析二者混合施用与常规磷肥对土壤有效磷的影响差异，以期为解决目前磷素利用率偏低及大量流失造成的污染等问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料采集与制备

1.1.1 供试土壤

土壤采样点选择吕梁山地区，该地区土壤类型以褐土为主，采样深度为0～10cm.经测定样品pH值为8.5，呈弱碱性，有效磷（AP）和全磷（TP）含量分别为15.82mg／kg、732.41mg／kg.采集后实验室内在45℃下烘干处理5d，混合过10目筛备用。

1.1.2 醋酸杆菌菌液（AS）制备

将醋酸杆菌菌种接种至琼脂培养基（酵母膏：2%，葡萄糖：1.5%，琼脂：1.5%，乙醇：3%，均为质量分数；pH：5.5～6.0），30℃下培养36h；之后接种至摇瓶中80mL液体培养基（酵母膏：2%，葡萄糖：1.5%，KH2PO4：0.45%，乙醇：3%，pH：5.5～6.0），进行振荡培养（转速180r／min，温度30℃，20h），获得醋酸杆菌种子液。将巨型球菌属接种至牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（牛肉膏：0.3%，蛋白胨：1%，NaCl：0.5%，琼脂：2%，均为质量分数；pH：5.5～6.0），30℃下培养48h；之后接种至80mL肉汤液体培养基（与肉膏蛋白胨琼脂培养基一致，但不添加琼脂）上振荡培养（180r／min，30 ℃，36h），获得巨型球菌种子液。将不同种子液加入由植物残体、酸碱调节剂和水组成的发酵罐中继续室温发酵30d得到AS。

1.2 检测方法

土壤全磷含量采用钼锑抗比色法（GB 9837-88）；有效磷含量采用碳酸氢钠提取法（NYT 1121.7-2014：7）.

1.3 试剂与仪器

本文中所有试剂均为分析纯。碳酸氢钠、磷酸二氢钾、碳酸钠、氢氧化钠购自国药集团化学试剂有限公司；钼酸铵、浓硫酸、酚酞、盐酸、酒石酸锑钾、抗坏血酸、2，6-二硝基酚购自天津市化学试剂四厂；磷肥与腐殖土购自山西天脊煤化工有限公司，参数见表1.

表1 磷肥与腐殖土参数Table 1 Relevant parameters of phosphate fertilizer and humus soil

采用美国康塔仪器微生物培养箱进行醋酸杆菌菌液的制备；UV-2102PC紫外可见分光光度计（上海尤尼柯）测定土壤TP、AP含量；NICOLET iS10傅里叶红外光谱仪（美国）鉴定菌液中基团类型。

1.4 土培试验

采用培养罐分装土壤（210g／罐），共设计11组土培样品，每组3个平行，取样时间分别为1、7、30、60、90d.添加剂延土壤垂向表层（记为0）与3cm（记为3）两种深度分别施用，试验用量为 HS：400 g／m2（即2.27g／jar）；肥料：40g／m2（即0.23g／jar）；AS：1mL／jar（去离子水稀释菌液至10mL）.试验过程中保持土壤含水率在15%左右。样品分组情况见表2.

表2 土培样品处理组Table 2 Treatment groups for soil culture samples

2 结果与讨论

2.1 醋酸杆菌菌液表征

2.1.1 FTIR分析

由图1可知，645cm-1的强吸收为—OH的弯曲振动，说明溶液中存在醇类物质，这与埃希氏巨型球菌三羧酸循环中产生醇类物质一致；1 644cm-1与3 300cm-1处的强吸收对应单体酸—CO羰基的强锐峰与羧酸中的—OH的吸收峰［14］，这与醋酸杆菌经糖酵解途径产生乙酸、埃希氏巨型球菌经呼吸作用产生的低分子量有机酸物质一致。说明自制菌液AS中含有机酸类物质与醇类物质。

2.1.2 高通量测序

在属水平级别对微生物菌液中主要物种（V3-V4区）进行分析（图2）.

图1 AS的红外谱图Fig.1 FTIR spectrum of AS

图2 属水平上菌液中主要rank reads数目Fig.2 Number of main rank reads in AS at the genus level

由图2看出，醋酸杆菌菌液中Acetobacter占46.58%，Megasphaera占21.6%，即主要为醋酸杆菌属与埃希氏巨型球菌属。以醋酸杆菌为例，其代谢有机终产物为乙酸［15］。研究证明在碱性土壤环境下，有机酸可活化Ca-P中的磷，同时酸根与钙离子络合，促进难溶性磷素的进一步释放［16］。因此本文自制菌液可满足土培试验解磷要求。

2.2 不同添加剂对土壤有效磷的影响

以第90d测定数据为例说明不同添加剂对土壤有效磷的影响（图3）.

图3 土培实验第90dAP／TPFig.3 AP／TP for soil culture experiments in ninetieth day

由图3可知，与空白组相比，不同施肥方式均显著提高了AP组分的含量。其中HA对碱性土壤AP的释放效果较单施常规磷肥更好（表层处：T2＞T4，3cm处：T3＞T5），即醋酸杆菌菌液与腐殖土共同施用后可有效促进土壤磷的释放。此结果与二者提供的有机酸（乙酸、腐殖酸等）有关。首先，本文中土壤样品呈弱碱性，在此条件下土壤磷受到钙的固定，主要以Ca—P的形式存在，占无机磷总量的80%以上［17］。已有研究表明，有机酸类物质中含有—COOH、—OH等官能团，它们在对某些肥料产生溶解作用的同时，通过占据土壤中阴离子专性吸附位点，与Ca2＋等离子螯合，降低了磷酸根等阴离子的吸附量，使一些被束缚的磷素得到释放；且有机酸的活化能力与其浓度、有效磷含量呈正相关［18-19］。其次，腐殖酸肥料能够调节土壤的pH值向中性方向发展，有益于土壤微生物生长，并激发其活性；同时可以有效降低土壤容重，增加土壤孔隙率，改善土壤的物理性质，提高有机质和其他速效养分的含量［20］。

此外，由图3也可看出，大部分施用腐殖土肥料样品中AP含量呈现出3cm处＞表层，可能原因为腐殖土中的有机质（腐植酸）间相互作用产生的絮状现象改善了土壤的团粒结构，使土壤的透水性提高，径流减少，剖面养分增加，有利于磷素发生交换吸附反应，从而提高了其在土壤中的移动性与有效性［21］。由于本文土培试验设计土层厚度较小，施肥深度与均匀度与田间施肥有较大差异，后续需要根据实际农田环境及种植作物等情况进一步深入探讨。

2.3 施肥时间对土壤有效磷的影响

图4、图5分别为土壤表层与3cm深处不同肥料施用后AP含量的变化。首先由图可以看出，T2、T3（腐殖土与醋酸杆菌液）处理组中AP变化趋势为0～30d内小幅下降，在第30d左右达到最低值；30d后含量提高，在第90d达到最大值，较刚施入时分别 增 加 10.23% （表层）、12.86% （3cm处）；较空白组分别增加38.69%（表层）、37.83%（3cm处），即与空白组相比，差异达到显著水平（P＜0.05）。刘胜亮等［22］通过将4种可产出乙酸的解磷细菌（不动杆菌、肠杆菌等）施入土壤后发现，土壤pH值在30～120d内呈逐渐降低趋势；AP含量在30d时较第1d有所下降；接种90d后，较60d有明显增长，该结果与本文试验结论基本一致。

图4 施肥时间对表层处（T1、T2、T4、T6）土壤有效磷的影响Fig.4 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）on the surface layer of the soil（T1，T2，T4，T6）

图5 施肥时间对土层3cm处（T1、T3、T5、T7）有效磷的影响Fig.5 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）in 3cm deep of the soil layer（T1，T3，T5，T7）

另外，T4-T7组AP含量在磷肥刚施入土壤时（0d）达到最大，之后基本处于下降趋势。在第90 d时，不同处理组各层AP含量关系为T2＞T6＞T4＞T1（表层）、T3＞T5＞T7＞T1（3cm），即 HA处理方式对土壤中难溶性磷的溶解优于常规磷肥。该现象反映出土壤单纯施用磷肥后，肥料磷更多地被土壤吸附，降低了磷素的有效利用，造成资源浪费［23］。

图6、图7中T8-T11曲线变化规律同T4-T7，即将磷肥与HA混合施用后，土壤AP含量在90d内基本处于下降趋势。不同之处在于0～90d范围内，T8-T11处理组在土壤各层AP含量均要高于HA处理组，说明外源磷素的引入使土壤TP含量增加，HA中有机质组分能进一步促进磷肥中的磷素解吸，从而提高了AP的含量。由此可以证明，在磷素水平较低的碱性土壤中，可同时施加HA与磷肥，使各形态磷素含量提高［24］。

此外，图4-图7中也显示出无论单独还是混合HA后施用硝酸磷钾肥对于AP含量的提高都优于硝酸磷肥，原因可能为肥料中更多的K＋（KCl、K2SO4）及NH＋对土壤固相表面H＋的交换作用，使土壤pH值下降，从而显著增加了AP的含量［17］。

图6 施肥时间对表层处（T1、T2、T8、T10）土壤有效磷的影响Fig.6 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）on the surface layer of the soil（T1，T2，T8，T10）

图7 施肥时间对土层3cm处（T1、T3、T9、T11）有效磷的影响Fig.7 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）in 3cm deep of the soil layer（T1，T3，T9，T11）

3 结论

为了探讨腐殖土与解磷微生物协同作用下对碱性土壤有效磷（AP）的影响，本文共设计了11组土培对比试验（90d）.结果显示，HA（腐殖土＋醋酸杆菌菌液混合施用）对AP的改善优于常规磷肥；在磷素匮乏土壤中，HA与常规磷肥混合施用更有利于促进AP含量的提高。推测HA对AP的影响机理为：腐殖土富含有机质（以腐殖酸为主），在改善土壤质地的基础上，能为菌液中微生物的代谢活动提供碳源；而醋酸杆菌等菌种能产生出低分子量有机酸，可与腐殖酸共同作用，有效降低碱性土壤的pH值，使土壤磷的形态发生改变，促进难溶磷的溶解。下一步研究可采用更多种类有机肥料，并结合田间试验，使结论更具普遍性。