普通级实验犬微生物学、寄生虫学控制标准介绍

2020-09-24盛雅洁肖春兰赵丽娟周正宇

甘肃畜牧兽医 2020年8期

盛雅洁，肖春兰，赵丽娟，周正宇

（苏州大学实验动物中心，江苏苏州 215123）

犬作为实验动物在解剖、生理以及代谢等生命科学的各个领域中起着至关重要的作用，因此广泛应用于各项科学研究[1]。但是实验犬的饲养往往多采用群体饲养，容易感染狂犬病、布鲁杆菌以及弓形虫感染等一系列人畜共患病，这些人畜共患病不仅直接影响到实验犬的健康，还会对相关工作人员生命健康造成一定的威胁[2]。实验犬的国家标准在提高实验犬的质量、保障相关科学研究中起了至关重要的作用。微生物学、寄生虫学质量控制是衡量实验动物质量的主要标准之一。关于实验犬质量的实验动物国家标准，包括微生物学和寄生虫学控制标准[3]。该标准的实施促进了实验犬检测技术与检测体系的发展，并达到了一定的标准化水平[4]。本文对实验犬的微生物学和寄生虫学质量控制的标准以及具体检测方法进行了相应的整理归纳。

1 检测规则

根据国标要求，普通级实验犬每3个月至少检测1次，要求选取成年动物进行检测。此外，国标对选取动物数量也进行了规定，取样数量由生产繁殖单元大小决定，要求群体大小＜100只时，取样数量应＞5只；群体大小在100～500只时，取样数量＞10只；群体大小＞500只时，要求取样数量＞20只。此外，在实际检测过程中，还往往要求取样时雌雄各半，因为雌性动物跟雄性动物对不同病原体的敏感程度存在一定的差异。

2 采样方法

首先对待检实验犬进行编号，然后进行外观检查，之后对不同病原体采取分别进行取样，包括皮肤毛发，血液以及粪便或者肛拭子。

2.1 毛发取样

采取用透明胶带粘取犬的毛发或者直接用镊子在实验犬的易感染部位拔取少许被毛，散放于载玻片上，用透明胶带压住（或加一滴生理盐水后，覆以盖玻片），编号待检。

2.2 刀片刮取皮层物取样

检测皮层内寄生螨类时还需用刀片刮取动物溃疡部位深层碎屑或挤破脓疮取其内容物，置于载玻片上，滴加氢氧化钠液化或者甘油使之透明后编号待检。

2.3 采血

国标推荐的采血方式为耳部无菌采血，但是实际操作中犬前肢臂头静脉更粗一点，并且位置好找，容易操作，往往采用前肢臂头静脉采血。血液需4℃冰箱过夜后分离血清，56℃恒温水浴灭活30 min后进行后续试验。

2.4 粪便或肛拭子

采集时应采集新鲜粪便或直接用无菌棉签采集肛拭子，置于无菌离心管中编号待检。

3 检测项目及标准

包括微生物学和寄生虫学控制标准，具体检测项目、检测依据及技术要求见表1。

表1 普通级实验犬质量控制标准及要求

3.1 微生物学质量控制

普通级实验犬的病原菌必须检测项目包括沙门菌、皮肤病原真菌、布鲁杆菌，检测标准分别为GB/T14926.1-2001,GB/T14926.4-2001以及GB/T14926.45-2001。

犬沙门菌又称犬副伤寒，是一种常见的人畜共患病，临床症状主要为呕吐、腹泻[5]。实验犬沙门菌的检测通常采集粪便或肛拭子，然后接种SS或DHL培养基进行直接分离培养，或者接种SF增菌液后转至SS或DHL培养基进行培养，挑选可疑菌落增菌后通过菌落形态、菌体特征以及生化反应进行鉴定。沙门菌在DHL和SS培养基上均形成无色透明表面光滑湿润的菌落，部分菌落带黑心。显微镜下沙门菌为革兰阴性杆菌，无芽孢，无荚膜。生化反应包括硫化氢试验、靛基质试验、尿素培养基试验、氰化钾培养及试验以及赖氨酸脱氢酶培养基试验，目前很多检验检疫机构多采用了全自动或半自动微生物检定仪进行鉴定，虽然前期仪器成本较为昂贵，但是可以更加方便快捷准确地对细菌进行鉴定，节省了不少人力物力。

皮肤病原真菌感染犬容易引起真菌性皮肤病，出现脱毛、皮肤瘙痒等症状。犬孢子菌和须毛癣菌是感染犬的最常见皮肤病原真菌[6]。皮肤病原真菌的检测则是刮取动物皮毛、鳞屑直接涂片或者通过培养基分离培养然后观察菌落形态进行检测。直接检查是将样本置于载玻片后滴加氢氧化钾二甲基亚砜液，盖上盖玻片10～15 min后显微镜下观察。分离培养则是将样本接种沙氏培养基，28℃恒温培养7～14 d后观察菌落形态，并进行涂片镜检。

布鲁杆菌是一种胞内寄生的病原菌，主要感染犬的淋巴系统和生殖系统，也是一种较为严重的人畜共患病[7]。布鲁杆菌的检测则是通过血清学方法进行，“S（光滑）型”和“R（粗糙）型”布鲁杆菌是犬必须排除的病原菌，国标根据布鲁杆菌标准抗原与犬血清试管凝集效价判定犬是否感染布鲁杆菌。试验方法包括“S”抗原试管凝集试验以及“R”抗原试管凝集试验。国标要求通过检测血清中布鲁杆菌抗体来检测实验犬是否感染布鲁杆菌，检测结果要求阴性。此外，中国实验动物协会还建立了布鲁杆菌检测的PCR方法的团体标准，可以更为准确地检测犬的布鲁杆菌。

普通级实验犬的病毒检测项目包括狂犬病病毒、犬细小病毒、传染性犬肝炎病毒以及犬瘟热病毒。这4种病毒均是急性、烈性、高度接触性传染病，犬一旦感染，很容易引起传染及死亡[8]。检测标准分别为GB/T14926.56-2008、GB/T14926.57-2008、GB/T14926.58-2008以及GB/T14926.59-2001。值得注意的是只有犬瘟热病毒的检测标准是在2001年发布后未经重新修订过，其余三个均是在2001年颁布标准的基础上于2008年经修订后重新发布，并增加了基础级犬的群体免疫抗体合格率。

狂犬病毒国标推荐的检测方法为酶联免疫吸附法，犬肝炎病毒以及犬细小病毒检测方法包括酶联免疫吸附试验以及血凝抑制试验，犬瘟热病毒的检测方法包括酶联免疫吸附试验以及免疫酶试验方法。这几种方法均为血清学方法，由于所有普通级实验犬均需要免疫，需要通过检测血清中病毒抗体水平来衡量免疫效果，要求血清中病毒抗体阳性，因此检测需采用血清学方法进行，不能够用PCR等方法进行替代，国标要求经检测后抗体效价达到阳性为合格，其中基础级犬群体免疫抗体合格率达到70%以上则可判断为该犬群免疫合格，计算方式如下：免疫抗体合格率=（被检动物抗体阳性数/被检动物总数）×100%。

3.2 寄生虫学质量控制

普通级实验犬的寄生虫学检测标准包括体外寄生虫（节肢动物）以及弓形虫，检测标准分别为GB/T18448.1-2001以及GB/T18448.2-2008。进行体外寄生虫检测应先进行肉眼观察，体外寄生虫感染严重时，可引起犬的脱毛、毛糙甚至由瘙痒引起溃疡、结痂。检查时首先进行外观检查，尤其要注意耳根、颈后、眼周、腹股沟等易感部位，然后直接拔毛进行取样或者用透明胶带粘取毛发进行取样，显微镜下观察是否有体外寄生进行判定，发现虫卵、幼虫、若虫、成虫等均判为阳性。

犬的弓形虫感染一般为隐性感染，但是当机体免疫力减弱时会出现高热稽留、食欲不振、呕吐、呼吸困难等临床症状[9]。国标弓形虫的检测方法则是通过血清学方法进行采用间接血凝法（IHA）或者间接免疫荧光法，其原理均为抗原抗体特异性反应，形成免疫复合物，检测血清中弓形虫抗体，结果要求阴性。