不同剂量肝素对老年脓毒症大鼠肠道功能的影响

巩固 王莹 赵广明 胡占升

(锦州医科大学附属第一医院重症医学科，辽宁 锦州 121000)

脓毒症是由严重感染引起宿主反应失调的全身炎症反应(SIRS)，亦是引发多器官功能障碍综合征(MODS)的最主要原因〔1〕。而在多个器官功能中，脓毒症时最早累及肠道〔2〕，当肠道损伤时，其通透性增加，肠屏障功能受损，肠道细菌及毒素进入循环系统，导致多种炎症介质释放，引发和加重失控性炎症反应综合征〔3〕，保护肠道功能可以减轻脓毒症导致的MODS，降低脓毒症休克的病死率。老年人群是脓毒症的高发病人群，肝素作为常用抗凝剂，可以改善脓毒症时凝血异常，抑制弥散性血管内凝血(DIC)的发生发展〔4〕。研究表明肝素具有一定的抗炎作用，可改善脓毒症患者的微循环障碍及 MODS所造成的不良影响〔5～8〕。在以往的研究中，关于不同剂量肝素对脓毒症肠道功能的影响的研究较少，本研究观察不同剂量的肝素对老年脓毒症大鼠肠道的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 戊巴比妥钠粉剂(5 g，美国Sigma公司)，肝素钠注射液(2 ml∶12 500 U，常州千红生化制药股份有限公司)，血D-乳酸(Lac)白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Western印迹试剂及抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，Tunel试剂盒(武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.2实验动物及分组 清洁级健康老年雄性SD大鼠(20～24个月)，体重200～250 g 60只，购于锦州医科大学动物房，大鼠饲养于清洁鼠笼中，温度22～26℃，每日照明时间10 h，标准饲料喂养，自由摄食摄水，喂养1 w后活动正常纳入该实验，60只老鼠按随机数字法随机分为5组，每组12只，分别为假手术(Sham)组、盲肠结扎穿刺(CLP)组、低剂量肝素(L)组、中剂肝素(M)组、高剂量肝素(H)组。

1.3脓毒症大鼠造模及给药 采用CLP法造模，在两个连续日的上午由同一组人员(3人)完成，术前大鼠禁食12 h，自由饮水，用1%戊巴比妥钠50 mg/kg进行麻醉，麻醉满意后，将大鼠仰卧固定，剪毛，安尔碘消毒，铺巾，沿腹部中线剪开皮肤4～5 cm，剪开肌肉腹膜后牵出盲肠，测量盲肠全长后在距盲肠远端1/2处以1号无菌丝线结扎盲肠，结扎后用12号针头在盲肠结扎的中间位置全层穿透，并轻挤出少许粪便，确保穿刺孔通畅。盲肠还纳回腹腔，逐层缝合腹壁。Sham组只暴露盲肠，不结扎穿孔。术毕L组、M组、H组分别皮下注射肝素100 IU/kg、200 IU/kg、250 IU/kg每4 h 1次，Sham组及CLP组皮下注射等剂量的生理盐水。大鼠送回原笼，大约2 h后麻醉复苏。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.4检测指标及方法 ①术后24 h所有大鼠取颈静脉血，全血离心5 min取上清血，-20℃冻存备用，待标本全部收集后用ELISA测定血D-Lac IL-1β、IL-6、TNF-α水平，操作严格按照试剂盒的说明书进行。②取血后颈动脉放血处死全部大鼠，取回肠组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定、脱水，透明、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色后光镜下观察各组大鼠肠组织病理性形态学变化；然后参照Chiu等〔9〕报道的方法进行肠组织损伤评分(Chiu6级评分标准)：0分：结构正常；1分肠黏膜绒毛顶端上皮下间隙增宽；2分：绒毛尖端上皮太高与固有层剥离；3分：绒毛两侧上皮成块脱落；4分上皮完全脱落，仅存固有层结构；5分：黏膜固有层崩解、出血和溃疡。③Western印迹法测定肠道组织紧密连接蛋白Occludin，炎性蛋白核转录因子(NF)-κB，通路蛋白TLR4的表达水平。将回肠组织称重剪成细小碎片并匀浆，取40 μg总蛋白按1∶4 体积比加入5×样品缓冲液，于沸水浴中煮5 min使蛋白变性。将处理好的样品按照预定的顺序加入浓缩胶的上样孔内进行电泳，转膜、用脱脂奶粉封闭，室温振荡60 min。一抗孵育4℃过夜，洗膜后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育，置于X光中显影，用IPP软件对扫描图像的目的条带进行灰度分析。④Tunel法测定肠道凋亡率：采用Tunel法检测回肠黏膜细胞凋亡情况，每组内每张切片随机选5个视野进行拍照，凋亡细胞核呈棕褐色，蓝色为细胞核为阴性对照，阳性细胞数/总细胞数为凋亡率。

1.5统计学处理 使用SPSS17.0统计软件进行SNK-q检验、t检验、秩和检验。

2 结 果

2.1一般性观察 各组大鼠术后2 h逐渐苏醒。4～6 h后除Sham组外,其他各组大鼠均出现活动减少,反应迟钝,眼周分泌物增多,停止摄食摄水等症状。12 h后 L组、M组、H组大鼠较CLP组症状有所改善，H组在12 h后开始少量摄水，少量活动，发绀减轻。

2.2各组血D-Lac比较 与Sham组相比，其他各组氧分压(PO2)值均显著下降，D-Lac含量均显著升高(P<0.05)；与CLP组相比，L、M、H组PO2值显著升高，D-Lac含量均显著下降(P<0.05)；L 组、M 组、H 组两两比较PO2、D-Lac含量最差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组血气分析及D-Lac的比较

2.3各组IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 与Sham组相比，其他各组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均显著升高(P<0.05)；与CLP组对比，L 组、M 组、H 组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均显著下降(P<0.05)；L 组、M 组、H 组两两比较IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

2.4回肠组织病理学观察及Chiu评分比较 与Sham组比较，其他各组肠道黏膜病理学损伤程度均显著加重(P<0.05)；与CLP组比较，L组、M组、H组肠道黏膜病理学损伤程度显著减轻(P<0.05)；L组、M组、H组肠道黏膜病理学损伤程度依次减弱，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1，表3。

表3 各组Chiu评分及凋亡率比较

2.5各组Occludin、TLR4、NF-κB表达比较 与Sham组比较，其他各组Occludin表达显著下降，TLR-4、NF-κB表达显著上升(P<0.05)；与CLP组比较，L 组、M 组、H 组Occludin表达显著上升，TLR-4、NF-κB表达显著下降(P<0.05)；L 组、M 组、H 组两两比较Occludin、TLR-4、NF-κB差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2、表4。

表4 各组Occludin、TLR-4、NF-κB蛋白相对表达水平比较

图2 Western印迹法测定Occludin、TLR-4、NF-κB蛋白表达

2.6回肠黏膜上皮细胞凋亡率比较 与Sham组比较，其他各组回肠黏膜上皮细胞凋亡率显著增加(P<0.05)；与CLP组比较，L组、M组、H组凋亡率显著降低(P<0.05)；L组、M组、H组组间比较，凋亡率依次下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3、图3。

图3 回肠黏膜上皮细胞凋亡情况(Tunel，×200)

3 讨 论

老年人群是脓毒症的高发人群，文献报道年龄是影响脓毒症发病和严重程度的独立风险因素，每增加10岁，其发病率呈指数幂增长，65岁以上的老年患者的发病率是65岁以下的13.1倍〔10〕。脓毒症发生最早累及肠道，1986年Meakins等〔11〕提出“胃肠道是MODS的始动器官”的著名论点，肠道作为机体应激的重要器官，作为人体的“储菌库”和“内毒素库”在脓毒症的发生、发展中扮演着非常重要的角色。当肠道损伤时，其通透性增加，肠屏障功能受损，微血栓形成及发生相关的微循环障碍，加剧肠上皮细胞的凋亡〔12，13〕，同时又会通过肠道内细菌及毒素移位刺激TNF-α、IL-1β、IL-6等大量炎症介质的大量释放导致其他重要器官功能障碍，甚至衰竭，是MODS的始动器官〔14〕。因此保护肠道功能是降低老年脓毒症病死率的关键。当肠黏膜受损时，其通透性显著上升，同时产道内病原微生物大批量生长繁殖，肠道内细菌进行无氧酵解的产物D-Lac增加，D-Lac可以通过损伤的肠黏膜进入血液导致血D-Lac水平升高，因此测定血浆D-Lac水平可以反映肠黏膜损伤情况，动物试验研究表明肠黏膜损伤与血中的D-Lac含量呈正相关。肠黏膜的机械屏障主要以上皮细胞，绒毛及血管内皮细胞间紧密连接(TJ)组成〔15〕，而Occludin蛋白是TJ形成的基础结构，在紧密连接的缝隙处起着结构性作用，它的缺失可以直接导致紧密连接结构的完整性失效〔16〕，在脓毒症的研究中发现，肠上皮通透性的显著增加及Occludin表达减少，导致细菌的异位及败血症死亡率增加〔17〕。肠道完整性异常，肠上皮细胞凋亡增加，在脓毒症模型中，肠上皮细胞凋亡的增加与死亡率的增加有关〔18〕。

本研究显示肝素干预后的老年脓毒症大鼠的血Lac明显降低，肠黏膜Occludin蛋白明显升高，并且与肝素应用的剂量有相关性。本研究还显示，模型老年大鼠肠黏膜结构发生了显著炎性渗出、坏死等病理改变，肠壁上皮细胞有较多凋亡，但肝素可显著减轻这些病理改变，且H组较M组降低程度更显著，提示肝素能阻止脓毒症所导致的肠黏膜病变，且这一作用与肝素的剂量呈正比。

脓毒症发生时，先天性免疫启动以防御病原微生物入侵，Toll样受体(TLRs)是病原体入侵的首道防线〔19，20〕，TLRs能识别外来病原体，传递下游信号，介导炎症因子的生成，其中TLR4是肠道固有免疫系统的重要成员，能识别革兰阴性菌细胞壁的主要成分〔21〕，触发了下游多条信号通路的激活，其中NF-κb的激活最为关键，使TNF-α，IL-1β，IL-6等生成增加，炎症介质又一步促进TLR4的表达，使受体与炎症介质之间形成一个正反馈环，导致炎症反应不断扩大〔22,23〕。本研究显示肝素干预后的老年脓毒症大鼠的炎症指标明显下降，并且与肝素应用的剂量有相关性。

关于实验中肝素剂量的选择出于以下考虑：①有研究显示健康成年SD大鼠活化凝血时间(ACT)的均值为48 s，远小于人类正常值(70～130 s)，大鼠达到同等抗凝水平所需要每公斤体重肝素剂量远高于人类，如使SD大鼠ACT达480 s并维持30 min需要单剂静脉注射肝素1 200 IU/kg〔24〕；②以成人(老年)急性肺栓塞所用肝素紧急抗凝的经验剂量500 IU/kg为参照，根据不同种属用药剂量换算公式可以换算为300 g大鼠所需剂量为2 000 IU/kg〔25〕；③有研究发现肝素150～300 IU/kg可以减少烧伤大鼠肠黏膜细胞凋亡和肠细菌移〔26〕；④在预实验中给予300 IU/kg皮下注射，24 h解剖大鼠时发现有组内大部分大鼠腹腔出血的情况，基于以上采用100 IU/kg、200 IU/kg、250 IU/kg 3个档次的肝素进行干预。

综上所述，肝素治疗对老年脓毒症大鼠的肠道功能具有一定保护作用，且与肝素应用的剂量相关，其机制可能与其增加肠道Occludin蛋白的表达，降低TOLL通路TLR4、NF-κB的表达从而减少炎症介质IL-1、IL-6、TNF-α及肠道上皮细胞凋亡。