紫球藻对沼液废水中氨氮、铜离子及抗生素磺胺二甲嘧啶的处理效果

2020-09-24胡政宇许智慧程鹏飞

生态与农村环境学报 2020年9期

彭瑶，胡政宇，肖鹏，许智慧，常婷，程鹏飞①

(1.宁波大学食品与药学学院，浙江宁波 315211；2.宁波大学海洋学院，浙江宁波 315211)

沼气工程发展的同时，大量富营养的养猪沼液废水也对水体环境以及人类健康造成严重危害[1]。养猪沼液废水是一种较难处理的有机废水，具有氮磷含量高、富含重金属及抗生素等成分的特点[2]。沼液既是污染源，又是农业资源，沼液富含的养分及生物活性物质，在作为生物肥料施用于农作物方面具有广泛的应用前景[3-4]。

在现代规模化饲养过程中，猪粪尿中氨氮(NH3-N)的淋溶性很大，会通过地表径流渗入地下水体，同时也会在土壤中逐渐积累，导致水体污染严重，破坏水环境系统平衡[5-6]。沼液废水中的氨氮在转化成氮气的过程中会产生大量硝酸盐和亚硝酸盐，是诱发高铁血红蛋白血症的主要因素，给人体造成严重危害[7]。另一方面，未经处理的含铜离子(Cu2+)废水进入江河湖泊，不仅污染土壤，还会被农作物吸收，影响农作物生长，造成减产或者更大的损失，同时还可通过植物根系进入食物链，在人体内聚集，给人体带来不容小觑的危害[8]。研究还发现，畜禽使用过的抗生素有25%～75%以母体药物形式从粪尿中排出体外，以代谢产物形式通过禽畜粪尿进入水体和土壤中，从而对环境造成潜在威胁[9]。磺胺二甲嘧啶是一类难降解、易吸附的抗生素，而养猪沼液中含有大量磺胺二甲嘧啶，将其作为肥料施用于农田会导致通过食物链富集引发生态风险[10]。

目前，处理沼液废水的方法主要包括还田应用、物理法、化学法以及厌氧发酵等工艺[11-12]。规模化养猪场废水一般采用厌氧-好氧组合工艺进行处理，然而由于厌氧处理后的沼液中含有大量难降解有机物，且其氮磷含量高，碳氮比低，因此，当采用接触氧化法、序批式活性污泥法(SBR)和氧化沟法等传统废水处理方法时，处理效果均不太理想，再加上运行不稳定，建设运行成本较高，故难以在工程中得到实际运用[13-14]。综上所述，处理养猪沼液废水中的氨氮、Cu2+以及抗生素(磺胺二甲嘧啶)是确保水环境达标排放的一项重要任务。

微藻具有特殊的结构和生理代谢作用，具有良好的生物净化功能，将其用于水体处理后还能收获潜在的具有很高应用价值的生物量和功能性产品[15]。利用藻类培养处理废水具有技术工艺简单、适应性广和处理效果佳等特点，因而其作为一种新型高效的生物技术得到了国内外的广泛研究[16]。将沼液的大规模处理和藻类的工厂化培养进行偶联，依靠微藻自身细胞的增殖及营养物质的积累，不仅有望使沼液排放达到国家标准，还能兼顾成本问题，在实现沼液废水资源化的同时，可降低微藻培养成本。

紫球藻(Porphyridiumcruentum)是一种单细胞红藻[17]，属于紫球藻科紫球藻属淡水藻类植物。紫球藻在生长过程中能够合成大量藻红蛋白和胞外多糖等多种高值活性物质，具有广阔的应用前景[18]。目前，关于紫球藻的研究主要集中在培养工艺的优化改良和多种生物活性物质的开发利用方面，利用紫球藻培养处理养猪沼液还鲜见报道。基于此，该文主要探究不同浓度氨氮、Cu2+及抗生素磺胺二甲嘧啶对紫球藻生长的影响，将培养的紫球藻用于处理养猪沼液废水，进而期望实现养猪沼液废水的资源化利用。

1 材料与方法

1.1 藻种来源与培养基

供试紫球藻(Porphyridiumcruentum806)由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库馈赠，紫球藻培养过程中所用培养基为KOCK培养基[19]，其成分配方见表1。

表1 KOCK培养基配方

紫球藻培养所用反应器为玻璃柱式反应器(图1)，内直径为0.05 m，柱高为0.55 m，反应液体积为0.9 L。反应器内部布置直径为5 mm的玻璃通气管，混合有φ(CO2)=1.5%的压缩空气(0.1 MPa)以100 mL·min-1速率通过通气管从反应器底部曝气，使培养过程中的藻液搅动并补充碳源。

1.2 氨氮、Cu2+及抗生素磺胺二甲嘧啶对紫球藻生长的影响

养猪场厌氧发酵后的沼液废水参数指标如下：ρ(氨氮)为512.00 mg·L-1，ρ(TP)为42.00 mg·L-1，ρ(COD)为663.00 mg·L-1，ρ(Cu2+)为0.94 mg·L-1，ρ(磺胺二甲嘧啶)为8.24 mg·L-1。以沼液废水参数指标为参照，以氯化铵为铵盐，向KOCK培养基中加入氯化铵(NH4Cl)，分别设置ρ(氨氮)为50、500和2 000 mg·L-1，并将其与KOCK培养基相比较，考察紫球藻生长情况；在正常KCOK培养基中分别设置ρ(Cu2+)为0.5、1.0和2.0 mg·L-1，并考察紫球藻生物量积累情况；同时以正常培养基为对照，分别设置ρ(磺胺二甲嘧啶)为5、10、20、100和200 mg·L-1，考察不同抗生素浓度对紫球藻生长的影响。紫球藻在沼液废水及KOCK培养基培养过程中的光照强度为80 μmol·m-2·s-1，培养时间均为10 d。

图1 紫球藻培养所用柱式反应器

1.3 紫球藻细胞产率的测定

紫球藻细胞生物量测定采用生物膜干重法。将孔径为0.45 μm、直径为50 mm、面积为0.001 m2的醋酸纤维滤膜用去离子水煮沸3次，在105 ℃烘箱中烘8 h至恒重，取出滤膜对其编号称重并记录质量(W1)，用移液器吸取5 mL待测藻细胞样品至抽滤装置内，抽滤至已称质量(W1)的滤膜上，将附着藻的滤膜放入105 ℃烘箱中烘8 h至恒重(W2)，用分析天平称量，并计算紫球藻细胞生物量(Wd，g·L-1)，其计算公式为Wd=(W2-W1)/5。紫球藻生物产率为单位培养时间的生物量(g·L-1·d-1)。

1.4 氨氮、Cu2+及抗生素磺胺二甲嘧啶的测定

采用纳氏试剂分光光度法(GB 7479—1987)测定氨氮浓度，采用原子吸收光谱法(PinAAcle900T，美国)测定Cu2+浓度；采用高压液相色谱(Alliance 2695 system，Waters，USA)配备Waters2487UV-VIS检测器测定废水中抗生素磺胺二甲嘧啶浓度。

1.5 数据分析方法

采用统计软件SPSS 10.0对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 不同浓度氨氮对紫球藻生长的影响

基于研究的可比性，设置紫球藻在正常KOCK培养基中及50、500和2 000 mg·L-1氨氮浓度梯度条件下的初始接种密度是一致的(图2)。

图2 不同浓度氨氮对紫球藻生长的影响

结果表明，对照组，50、500和2 000 mg·L-1氨氮处理组紫球藻由初始生长量0.33 g·L-1分别增长至培养10 d时的1.67、1.74、0.85和0.68 g·L-1，相应的生物产率分别为0.134、0.141、0.052和0.035 g·L-1·d-1(图2)。在培养前期(0～4 d)，各实验组均保持良好生长。培养4 d时，ρ(氨氮)为500、2 000 mg·L-1处理组紫球藻生物量明显低于正常培养基和50 mg·L-1氨氮处理组。4 d后，正常培养基和50 mg·L-1氨氮处理组生物量较高，且生长速率较快；500 mg·L-1氨氮处理组生物量变化不大；2 000 mg·L-1氨氮处理组生物量比4 d时有所下降，其后虽有所增长，但生物量基本保持在一定范围内。这可能是因为紫球藻对铵态氮的吸收能力较弱；在不同浓度氨氮条件下，微藻生长趋势较为缓慢，尤其是在500和2 000 mg·L-1氨氮浓度条件下藻细胞生长较慢。相对而言，50 mg·L-1氨氮浓度条件下微藻生长较好。一定的氨氮浓度条件下微藻能较好地生长，过低的氨氮浓度导致营养不足，影响微藻的生长代谢，而过高的氨氮浓度则产生较多铵离子而无法迅速转移到氨基酸的合成中，导致微藻生长迟缓或死亡[20]。50 mg·L-1氨氮浓度可能较低，而500和2 000 mg·L-1氨氮浓度则可能超出了紫球藻的耐受范围，导致藻细胞生长迟缓。

2.2 不同浓度Cu2+对紫球藻生长的影响

由图3可知，紫球藻在正常KOCK培养基中和0.5、1.0和2.0 mg·L-1Cu2+浓度梯度条件下的生物量是相当的。在培养前期(0～4 d)，紫球藻在正常培养基中的生长速率较快，其余3个Cu2+浓度处理组生长速率相差不大。4 d之后，正常培养基与0.5、1.0 mg·L-1Cu2+处理组生物量继续累积，其中，0.5、1.0 mg·L-1Cu2+处理组生物量累积趋势基本保持一致；而2.0 mg·L-1Cu2+处理组紫球藻生物量在6 d时出现下降，然后再继续生长，这可能是因为培养基氮源减少而Cu2+浓度相对过高，紫球藻需要重新适应相应的生长环境。由图3可知，对照组，0.5、1.0和2.0 mg·L-1Cu2+处理组紫球藻由初始生长量0.93 g·L-1分别增长至2.36、1.81、1.83和1.58 g·L-1，相应的生物产率分别为0.143、0.088、0.090和0.065 g·L-1·d-1(图3)。

图3 不同浓度Cu2+对紫球藻生长的影响

培养10 d后，Cu2+浓度越高，紫球藻生物产率相对越低，Cu2+处理组生物产率均低于正常培养基处理组。因此，沼液废水中金属Cu元素是限制紫球藻生长的关键因子。

2.3 不同浓度磺胺二甲嘧啶对紫球藻生长的影响

不同浓度磺胺二甲嘧啶对紫球藻生长的影响见图4。培养10 d内，磺胺二甲嘧啶浓度分别为5、10、20、100和200 mg·L-1处理组紫球藻生物量均低于正常KOCK培养基处理组；培养10 d时上述浓度组紫球藻生物量分别为1.18、1.42、1.30、0.98和0.88 g·L-1，正常培养基处理组生物量为1.60 g·L-1(图4)。比较不同浓度抗生素处理组发现，10 mg·L-1磺胺二甲嘧啶对紫球藻生长的影响相对较小，生物产率较高，为0.12 g·L-1·d-1(图4)。因此，较低浓度(5、10和20 mg·L-1)磺胺二甲嘧啶对紫球藻生长影响不大；在这3种浓度中，5 mg·L-1浓度条件下藻细胞生物量略低于较高浓度(20 mg·L-1)条件下的值，这可能是由于藻细胞生长代谢所需营养物质抗生素浓度较低所致。但当ρ(磺胺二甲嘧啶)为100和200 mg·L-1时藻细胞生长受到明显抑制，且浓度越高，抑制效果越明显。

图4 不同浓度抗生素磺胺二甲嘧啶对紫球藻生长的影响

2.4 紫球藻对KOCK培养基中氨氮、Cu2+及抗生素磺胺二甲嘧啶的吸附效果

基于上述研究结果，将紫球藻分别培养于含有最佳浓度污染物的KOCK培养基中(50 mg·L-1氨氮、1.0 mg·L-1Cu2+和10 mg·L-1磺胺二甲嘧啶)，考察藻细胞对此3类污染物的吸附效果。在相同条件下，紫球藻对氨氮、Cu2+和抗生素磺胺二甲嘧啶的吸附效率分别为(73.2±3.2)%、(54.3±2.8)%和(56.9±3.6)%。一般而言，包括紫球藻在内的微藻通过光合作用，能够有效地吸附水体中微量元素等营养物质，如氨氮、Cu2+和抗生素磺胺二甲嘧啶，为藻细胞生长及其代谢产物的合成提供营养需求，微藻细胞通过其非均匀表面的单层与多层吸附达到去除水体中抗生素的效果[21]。而微藻对重金属的去除大多主要通过物理吸附和化学吸附(如络合、螯合等)方式。笔者研究中，紫球藻对金属Cu2+及抗生素磺胺二甲嘧啶的具体吸附机制还需进一步的实验研究。

3 讨论

笔者研究主要侧重于紫球藻对养猪沼液中存在的难处理物质氨氮、Cu2+及磺胺二甲嘧啶的去除效果。紫球藻富含胞外多糖，其细胞外层的水溶性多糖是主要由葡萄糖、木糖和半乳糖等组成的易溶于水的多聚体，具有多种特殊的生物活性作用，对氨氮、Cu2+和磺胺二甲嘧啶等具有一定的吸附(去除)效果[22]。不同浓度氨氮对紫球藻生长状况的影响程度不同(图2)，笔者将紫球藻分别置于不同浓度氨氮(50、500和2 000 mg·L-1)的KOCK培养基中培养，结果表明，紫球藻在低浓度(50 mg·L-1)氨氮中生长状况较好，这说明不同浓度氨氮影响紫球藻细胞组分的合成。一般而言，高浓度氨氮会抑制藻类生长，在一定浓度范围内，随着氨氮浓度的适量增加，藻细胞的生长状态会较好，但如果氨氮浓度超过一定的值，将产生氨毒性[19,23-24]，对藻类生长起抑制作用，进而限制藻类处理污水的应用。另一方面，氨氮浓度过低会抑制浮游藻类生长[25]，而笔者研究中低浓度(50 mg·L-1)氨氮对紫球藻的生长影响不大，这可能与不同藻株对氨的耐受性不同有关。

养猪沼液废水中Cu2+浓度较高，高浓度Cu2+对大多数微生物具有毒性，沼液废水中Cu2+可以抑制紫球藻生长，从而降低沼液废水的处理效率[26]。Cu2+是养猪产业中不可或缺的金属元素，不同浓度Cu2+的累积会引起藻类植物生命过程的改变，如矿物营养、光合作用、酶活性等，从而抑制藻细胞的生长与代谢[27]。高浓度Cu2+对藻类具有严重的毒性作用，会导致其缺铁，抑制叶绿素的合成，进而影响藻类光合生长[28-29]。由图3可知，在高浓度Cu2+条件下，紫球藻生物量低于KOCK培养基处理组。紫球藻在2.0 mg·L-1Cu2+浓度条件下生长较差，其生长状况均低于其他两组(0.5、1.0 mg·L-1)。紫球藻对ρ(Cu2+)为1.0 mg·L-1的KOCK培养基中Cu2+去除效率为54.3%，所以优化Cu2+浓度是紫球藻处理含Cu2+沼液废水的重要条件[30]。同样，在利用沼液养殖紫球藻过程中若优化氨氮、Cu2+和抗生素磺胺二甲嘧啶浓度，则可使紫球藻对其的去除效果达到最优。

不同浓度磺胺二甲嘧啶对紫球藻的生长影响不同，藻类对磺胺二甲嘧啶的敏感性差异很大，有的抗生素对藻类有很高的毒性，对藻类生长产生不良影响。由图4可知，随着磺胺二甲嘧啶浓度的增加，紫球藻生物量均低于KOCK培养基。一般来说，磺胺二甲嘧啶可抑制水生细菌的繁殖，在抑菌方面表现出强大作用，而与细菌相比，微藻对抗生素具有更强的耐受性[31]。不同浓度磺胺二甲嘧啶会干扰藻类的健康生长，导致其增殖劣于正常条件下生长的藻类，产量下降，功能缺失。而过高浓度磺胺二甲嘧啶可以通过杀死藻类营养生长所需的微生物，从而改变藻细胞的功能成分，进而影响沼液废水的资源化[32]。

由于微藻具有特殊的细胞结构与特性，对沼液废水中金属元素和抗生素具有富集(或吸附)效果，藻细胞与金属离子和抗生素结合的可能位置见图5。

A为抗生素，M为重金属。

抗生素和金属通过吸附在细胞表面而富集，或通过胞质配体、金属硫蛋白等胞内分子结合[33]。不同抗生素主导的吸附机制也不尽相同，沼液废水中金属离子和抗生素的去除主要通过吸附作用和生物降解，利用了抗生素的脂肪族和芳香族基团与微藻(微生物)的亲脂性细胞膜或污泥脂质部分的疏水分配作用，带电的化合物基团与微生物及惰性颗粒表面还会发生静电作用[34]，吸附作用会受到物质自身亲脂性和静电作用的影响。藻细胞吸附重金属是一个复杂的物化与生化过程，藻细胞富集重金属主要包括生物吸附和生物富集两个机制(图5)[35]。藻细胞对抗生素和重金属的选择性吸附与吸附效率主要由细胞壁性质决定，通过细胞壁上的多糖、蛋白质、脂类等具有的羟基、羧基、氨基、酰胺基等带负电荷的官能团与金属阳离子静电结合或络合而起作用[36]。藻细胞内存在金属离子的结合位点，胞内结合通常与藻细胞的解毒机制有关，如藻细胞在重金属环境中可以诱导产生类金属硫蛋白来束缚金属，从而达到富集重金属的目的[37]。

紫球藻的生长受多种因素影响，所以利用培养的藻类处理养猪沼液的研究需要考虑众多因素的影响。笔者研究侧重于利用培养的微藻来处理养猪沼液，尤其是通过富含多糖、蛋白质或油脂等高价值组分的藻类来处理废水中氨氮，以及难处理的重金属、抗生素等物质，不仅可以降低微藻培养成本，还有望缓解由养猪沼液造成的环境问题，为微藻培养-废水处理资源化利用提供新的可能方向。