小鼠颅脑爆震伤早期评估预测研究

黄馨瑶，王雪雯，柳云恩，李雪玉

北部战区总医院1.急诊医学科 全军重症(战)创伤救治中心实验室 辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室；2.护理部，辽宁 沈阳 110016

爆震伤极易导致创伤性脑损伤[1]，常诱发肢体感觉运动障碍，损伤学习及认知等能力的损伤[2]。创伤性脑损伤(blast-induced traumatic brain injury，bTBI)的病理生理过程有其特有性质，目前，对于bTBI的救治方案主要根据临床脑损伤的常规救治方法进行诊疗，而早期筛选和评估的相关研究较少。本课题采用实验室爆震伤仿真装置，通过建立爆震伤模型，分析小鼠脑组织中病理结果变化，研究颅脑损伤的早期病理生理，探寻识别早期颅脑爆震伤可靠指标。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 选取20只健康的SPF级(c57BL/6)小鼠(雄性，体质量约18～22 g)，由医院的创伤救治中心实验室提供，动物自由饮食、饮水。压力感应器购自美国GE公司；食用白色素购自Palmer Paint Products公司。

1.2 研究方法

1.2.1 实验动物及分组 应用随机数字表法将20只小鼠平均分为正常对照组和bTBI模型组，每组各10只。

1.2.2 爆震伤模拟装置的设计 内部装有的空气压缩器主要连接空气压力泵和电源，主体上方采用钢丝网顶面以固定保护罩[3]。采用硬质塑料的1个圆筒作为其保护装置，在另一侧的筒壁做出与小鼠头部相等大的一个圆孔，以便露出小鼠头部。爆发出的压力数据由压力感应器测量，数据的采集通过连接数据线将数据传至电脑终端。

1.2.3 小鼠bTBI模型的建立 保护舱内放置小鼠， bTBI模型组小鼠采用10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉。将小鼠的头后部露出来，铝膜(1.4 mm)放置在中间，再将舱内小鼠固定在钢丝网上。电源连接后用压缩空气，大于铝膜承受的压力最大值时，发生破裂，其中爆发的巨大冲击波力量冲击到小鼠头部正上方。爆炸后，需要对小鼠实施抢救，抬高小鼠下颌使其正常呼吸，存活小鼠送至饲养室内正常喂养。正常对照组仅予以麻醉处置，在相同的时间点采集标本，进行病理检测。

1.2.4 Morris水迷宫 将圆形池内装满水，黑色池壁。采用食用白色素使水不透明，并维持恒温(22℃±1℃)。将水池划沿顺时针方向分4个象限，同时将平台放置在第4个象限中。小鼠的游泳路径采用池上的电子摄像机拍摄并系统分析跟踪[4]。逃逸潜伏期是小鼠找到平台所用时间的均值[5-6]。建模成功后7 d，两组小鼠均以头朝壁的方向放入水池，放入位置为随机选取的4个象限起点，记录进入水下平台的次数。这期间每天训练4次，训练共7 d，每次训练的间隔时间为20 min。将逃逸潜伏期和穿越平台次数作为其认知能力和空间记忆能力的判定指标。

1.2.5 HE染色及病理变化 将固定好的脑组织进行常规的石蜡包埋和切片，厚度2 μm。首先脱蜡、水化石蜡切片，通过染色试剂盒进行HE染色，酒精分化选用1%盐酸持续3 s，再用自来水持续处理5 min。返蓝后，采用伊红染色，最终在显微镜下观察小鼠脑组织的病理改变情况[7-9]。

1.2.6 蛋白质印迹法检测 成功建立小鼠爆震伤模型，1周后注射10%水合氯醛将小鼠麻醉，眼球放血后将小鼠处死。10%的甲醛溶液固定小鼠的脑组织(每组各5只)，应用HE病理染色、蛋白检测，将每组中其余的5只小鼠的脑组织放至液氮罐里[10]，取脑组织置于冰上融化后，离心取其上层的蛋白溶液，测定其中的蛋白浓度后予以配平。在TBST(含0.05% Tween-20)中封闭1 h，再分别用S-100β、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)多克隆抗体及鼠抗GAPDH单克隆抗体于4℃下孵育过夜。TBST漂洗3次，二抗室温孵育1 h，化学发光检测，凝胶成像采集图像[11]。

2 结果

2.1 小鼠的行为学改变 建模后，bTBI模型组小鼠无死亡。建模3 h内，小鼠均清醒，行动较迟缓，4 h小鼠进食、水，活动速度有所增加，但与正常对照组相比较，活动较迟缓。

2.2 两组小鼠的认知能力及空间记忆能力比较 建模后7、14 d，bTBI模型组小鼠进入平台的次数分别为(1.33±0.15)、(2.50±0.14)次，均明显少于正常对照组的(1.71±0.12)、(3.35±0.21)次，两组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。建模后7、14 d，正常对照组小鼠找到平台位置的时间为(27.80±1.23)、(19.49±1.32)s，均明显短于bTBI模型组的(38.82±3.21)、(26.43±2.41)s，两组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠的活动轨迹显示，正常对照组小鼠围绕平台的活动轨迹较规律，bTBI模型组的活动轨迹相对较分散。见图1。

2.3 两组小鼠的脑组织变化情况比较 解剖后，bTBI模型组小鼠的脑组织边缘较钝，组织边缘棱角不清晰，有明显的水肿表现；正常对照组脑组织体积明显缩小，组织边缘清晰，可见明显的血管及组织结构。见图2。

2.4 两组小鼠的海马区神经元比较 正常对照组小鼠海马区神经元细胞排列规则，无损伤；实验小鼠的脑组织中海马区神经元发生了变性，同时,锥体细胞发生肿胀且不规则排列。见图3。

2.5 蛋白质印迹法检测结果 bTBI模型组小鼠脑组织氧化应激指标s100β、NSE和MBP的表达量均显著高于正常对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

3 讨论

目前，由于反装甲武器的大范围使用，装甲车以及坦克乘员频繁遇到闭合空间以内的爆炸伤，在现代城市作战中,闭合空间内往往发生爆炸伤。此外，在和平时期，恐怖分子针对闭合空间以内实施爆炸袭击亦时有发生。对于此类事件研究较多的是创伤性以及开放空间的颅脑外伤和爆炸伤。然而，针对闭合空间以内的bTBI相关研究较少。颅脑爆震伤是指爆震所产生的冲击波致大气压急速改变，最终对颅脑形成冲击性损伤[11]。头部外伤在众多爆炸伤中占较大比例[12]。

本研究结果显示，bTBI模型组小鼠的脑组织边缘较钝，棱角不清晰，有明显水肿表现，而正常对照组小鼠的脑组织体积明显缩小，边缘清晰，能看见明显血管及组织结构。这表明，正常对照组小鼠的海马区分布较为规律，且几乎没有发生损伤,bTBI模型组小鼠的海马区则出现神经元变性。有研究通过建立颅脑爆震伤模型，在伤后24 h行头颅MRI检查,结果病理学提示，组织出现不同程度水肿[13]。扶宇等[14]通过建立小鼠bTBI模型，观察爆炸后小鼠的存活率以及其大脑神经元等发生变化的程度，采用HE染色法观察爆震伤后小鼠的大脑组织的病理变化情况，结果表现为染色数目逐渐降低，神经元胞体逐渐水肿[15-16]。近年来，有研究发现，血清或脑脊液中S-100β水平与神经系统疾病具有相关性，其可作为颅脑损伤标志物，并且逐步推向临床研究中[17]。另有研究显示，大脑中仍存在尚未完全死亡或尚未完全丧失功能的神经元细胞，而根据大脑可塑性这一理论，借助神经元细胞对信号的解码以促进脑组织分泌生物活性等物质，使机体适应其病理学改变[17]。

通过颅脑爆震伤动物模型可研究其病理变化过程，但其爆震的可控度及精确度尚不明确，有待进一步研究。bTBI可降低小鼠的认知能力、损伤小鼠的海马区神经元等。通过建立bTBI早期筛选评估模型可知，检测大脑标志物s100β、NSE和MBP的表达变化，有助于对早期bTBI进行快速筛选识别。