高效液相色谱法测定黑色素瘤小鼠尿液中达卡巴嗪

岳玉华, 周炳均, 艾佳媛, 封 顺

(西南交通大学生命科学与工程学院, 四川 成都 610031)

图 1 达卡巴嗪的结构式Fig. 1 Structure of dacarbazine

黑色素瘤是皮肤癌中恶性程度最高的一种肿瘤,近年来其发病率和死亡率急剧增加[1-4]。目前临床治疗黑色素瘤多采用手术切除、放疗、化疗和免疫治疗等手段[5]。达卡巴嗪(dacarbazine, DTIC)是美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准的第一个治疗黑色素瘤的化疗药物[6,7],目前仍被广泛应用于黑色素瘤的治疗。DTIC在体内主要经肝脏代谢,但部分药物仍以原药形式经尿液排出[8]。这就意味着可以通过监测尿液中DTIC的含量来评估其在人体内的利用率和转化率,进而对其治疗效果进行评价。

尿液作为唯一能够在无损条件下大量获得的体液,在生命分析中有着重要的地位。然而尿液成分相对复杂,基体干扰大,对尿液中微量或痕量组分的分析存在着一定困难。从图1结构式可以看出DTIC是一种强极性弱碱性化合物,这使得采用常规反相色谱分离时,DTIC会出现严重拖尾;同时极性又非常大,使得其在C18柱上保留较弱,出峰时间过早,基质干扰较大,难以实现准确定量[9]。为实现对尿液中DTIC的准确分离与分析,人们进行了大量工作,如Fiore等[10]以C18为分离柱,0.5 mol/L NaAc (10%的浓磷酸调到pH 7.0)和含25%乙腈的0.05 mol/L NaAc (10%的浓磷酸调到pH 5.5)为流动相,采用梯度洗脱的方式,初步实现了对尿液中DTIC的分析,但峰拖尾严重,效果不佳。Tate等[11]在流动相中引入甲酸铵,以0.1%甲酸铵水溶液(pH 5.5)/甲醇/水(90∶5∶5)为流动相,峰形得到了一定程度的改善,但DTIC在3 min即出峰,与死时间相隔过短。Safgren等[12]用三乙胺磷酸铵溶液代替甲酸铵水溶液,峰形得到进一步改善。King等[9]也使用强酸性流动相(pH 3的磷酸缓冲溶液),但结果仍不令人满意。如何快速、简便、准确地对尿液中DTIC进行定量分析仍然是一个难题。基于上述原因,本文通过改变流动相体系,采用甲醇/乙腈混合溶剂与磷酸盐缓冲溶液,实现了在等度洗脱的条件下对色素瘤C57BL/6小鼠尿液中DTIC的分离与分析。

尽管DTIC作为一线化疗药物被广泛用于黑色素瘤的治疗,但其疗效并不令人满意,5年存活率仅为15%～20%[13,14]。为了提高其疗效,临床常推荐辅以营养助剂[15,16],但若是口服营养辅助剂使用不当,会增加患者的不良事件风险[17,18]。蓝莓为“水果之王”[19],富含花青素(anthocyanin),具有许多药理作用[20-23]。在前期工作中我们发现蓝莓花青素也对黑色素瘤表现出一定的抑制作用。本文将所建立方法应用于蓝莓花青素(BA)辅助治疗过程中小鼠尿液中DTIC含量的监测,并对BA是否可作为黑色素瘤小鼠口服营养辅助剂进行了初步研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪,配1525二元泵、2707自动进样器、2998二极管阵列检测器(美国Waters公司)。高纯水(艾柯纯水仪)

色谱纯甲醇、乙腈(美国Fisher公司),分析纯丙酮、磷酸二氢钠(成都市科隆化学试剂厂)。注射用达卡巴嗪(广东岭南制药有限公司,批号:H20055753)、人工牛黄甲硝唑胶囊(重庆迪康长江制药有限公司,批号:H50021645)、蓝莓花青素(美国GNC,批号:196912)。

1.2 溶液配制

DTIC标准溶液:称取DTIC 10.0 mg,加入适量甲醇溶解,在10 mL棕色容量瓶中用甲醇定容,制得1.00 mg/mL DTIC贮备液,置于冰箱保存备用。

人工牛黄甲硝唑标准溶液:称取人工牛黄甲硝唑10.0 mg,用适量甲醇溶解后,于10 mL棕色容量瓶中用甲醇定容,制得1.00 mg/mL牛黄甲硝唑母液。以流动相进一步稀释,制得质量浓度为250 μg/mL的标准贮备溶液,置冰箱保存备用。

1.3 色谱条件

色谱柱:Shimadzu-GL ODS柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相为甲醇/乙腈(1∶1, v/v)-0.01 mol/L磷酸二氢钠(用1%氨水调节pH至6.5)(20∶80, v/v);洗脱时间:15 min;流速:1 mL/min;检测波长:280 nm;柱温:35 ℃;进样体积:10 μL;牛黄甲硝唑为内标。

1.4 造模及给药

健康C57BL/6雌性小鼠,体重18±2 g,购于成都达硕实验动物有限公司。自由进食饮水,适应性饲养5天后采用皮下注射法将B16-F10细胞(1×106个/mL)接种于小鼠右下腋,每只100 μL,正常组注射等量生理盐水。每日观察皮毛、食欲、活动及成瘤情况。造模成功后,随机分为正常组(未接种肿瘤的正常黑色素瘤小鼠)、模型组(接种肿瘤但未进行给药的黑色素瘤小鼠)、BA组(22.5 mg/kg;灌胃给药[i.g.];每日一次), DTIC组(70 mg/kg;腹腔注射[i.p.];每4日一次)、BA+DTIC组(BA及DTIC给药方式同上),每组8只,正常组及模型组灌胃等量的生理盐水,每日1次。每3天测量一次肿瘤体积,给药结束后,小鼠脱颈处死(实验流程见图2)。

图 2 实验流程图Fig. 2 Flow chart of experiment s.c.: subcutaneous injection; i.g.: intragastric administration; i.p.: intraperitoneal injection. Arrows were the time of DTIC administration and urine collection.

1.5 尿液的收集及处理

C57BL/6小鼠禁食12 h后给药,然后用代谢笼收集尿液,每4天收集一次晨尿,共收集5次(如图2所示)。将收集到的尿液在4 ℃下3 000 g离心10 min,除去固形物(2 h内进行)。上清液置于-80 ℃冰箱中保存。分析前,取出尿样室温下自然解冻,振荡。取200 μL上清液于1.5 mL的EP管中,加入800 μL的冷丙酮(冷丙酮与样品的体积比为4∶1),剧烈振荡之后放入4 ℃冰箱中静置30 min。4 ℃下12 000 g离心15 min以去除大分子,吸取上清液,真空冷冻干燥。样品用1 mL流动相溶液复溶,0.22 μm滤膜过滤,然后进行HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

从图1可以发现,DTIC含有多个杂原子,极性较大,同时又含有多个氨基,说明其具有一定碱性。选择常规流动相体系时,DTIC在C18柱上的保留较弱,同时会出现峰形拖尾的情况。为改善峰形,增加保留时间,提高定量准确性,考察了DTIC在不同pH值的缓冲盐体系(磷酸盐、醋酸铵等)、乙腈、甲醇及乙腈/甲醇不同体积比的混合液等流动相体系中的保留行为,以保留时间和分离度为指标,确定最优色谱条件(见1.3节)。在此条件下正常组小鼠尿液样品和正常组小鼠加标尿液样品的色谱图见图3。从图3中可以看出,达卡巴嗪保留时间在5.3 min,尿液中的内源性物质对达卡巴嗪干扰少,峰形良好。

图 3 (a)正常组小鼠尿液样品、(b)正常组小鼠加标尿液样品和(c)DTIC组小鼠尿液样品的色谱图Fig. 3 Typical HPLC chromatograms of (a) urine samples of normal mice, (b) spiked urine samples of normal mice and (c) urine samples of DTIC groupDTIC: 5.3 min; metronidazole: 9 min.

表 1 DTIC在C57BL/6小鼠尿液中3个加标水平下的

2.2 方法学考察

2.2.1线性范围及检出限

分别向正常组小鼠尿液样品中加入适量DTIC贮备液,配制质量浓度分别为0.25、0.50、1.00、10.0、100、250、500和1 000 μg/mL的系列工作溶液,经HPLC分析。以DTIC质量浓度为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y)进行线性回归,线性方程y=3 580x+39 362(r2=0.999),结果表明在0.25～1 000 μg/mL范围内线性关系良好,DTIC的检出限和定量限分别为0.12 μg/mL和0.25 μg/mL(基于信噪比(S/N)=3和S/N=10)。

2.2.2回收率和精密度

移取已知含量的DTIC标准贮备液适量,用正常组尿液稀释至低、中、高3种质量浓度(50.0、375、500 μg/mL)作为待测溶液,经1.5节处理后,HPLC测定。由表1可见3个加标水平下的平均回收率在98.9%至102%之间,RSD小于3.2%。

取正常组尿液,加入一定量达卡巴嗪对照品溶液,配制成质量浓度为50.0、250、500 μg/mL的样品,在优化后的色谱条件下测定。同一天重复测定6次,连续测定3 d,分别考察日内和日间精密度。该法日内和日间RSD均在5%以内,见表2。上述结果表明所建方法重现性良好,可应用于黑色素瘤小鼠尿液中DTIC的测定。

2.3 蓝莓花青素对达卡巴嗪治疗黑色素瘤的影响

将图2收集到的5个尿样经1.5节处理,在优化后的色谱条件下进行分析,计算出尿液中DTIC的含量。从表3中可以发现,在第1次到第3次给药期间,DTIC组黑色素瘤小鼠尿液中DTIC含量呈下降趋势,说明DTIC的利用率逐渐升高;但到第4和第5次给药,DTIC利用率大幅下降,此时黑色素瘤已恶化至晚期。而在黑色素瘤早期和中期,由于BA的引入导致BA+DTIC组对DTIC的利用率增加;但在黑色素瘤晚期时,BA的引入并不能促进小鼠对DTIC的利用。

表 3 不同给药次数C57BL/6小鼠尿液中DTIC的含量(n=3)

图 4 BA/DTIC对黑色素瘤C57BL/6小鼠(a)体重和(b)肿瘤体积的影响(n=3)Fig. 4 Effect of BA/DTIC on (a) body weight and (b) tumor volume in C57BL/6 mice (n=3)

为进一步研究,我们对小鼠体重和肿瘤体积随时间的变化进行了统计。从图4a中可以发现,随着肿瘤的增加,模型组及BA组小鼠体重增加。但是与正常组相比,各组小鼠体重无显著性差异(p>0.05)。由图4b可知,模型组肿瘤体积增长最快。DTIC组和BA组肿瘤体积较模型组增长速度均变缓(p<0.05),表明BA及DTIC都具有一定抑制黑色素瘤生长的作用。然而BA+DTIC组的肿瘤生长速度显著高于DTIC组(p<0.05),这又意味着BA作为营养辅助剂与DTIC共同作用于黑色素瘤C57BL/6小鼠时,BA的摄入没有起到提升疗效的作用,反而在一定程度上降低了DTIC对黑色素瘤小鼠的疗效,而该结果与尿液中达卡巴嗪含量测定结果存在矛盾。

花青素及其代谢产物是细胞色素P450酶(CYP450)的弱抑制剂。同时Mauray等[24]发现越橘中提取的花青素可以下调细胞色素P450亚酶CYP2E1的表达,DTIC在肝脏中要通过CYP450激活才能产生作用,其中CYP1A2和CYP2E1起重要作用。蓝莓中的花青素与其他植物中提取的花青素具有相同的母核,因此性质相似。推测BA的引入对CYP450酶代谢造成了影响,进而干扰了DTIC在体内的代谢,最终导致DTIC实际利用率下降。此推测需要进一步通过实验去证实[24-27]。

3 结论

本文发展了一种HPLC方法,在等度洗脱条件下,快速对尿液中DTIC准确定量。该方法简便,可靠,线性范围广,便于推广。将该方法成功应用于黑色素瘤C57BL/6小鼠不同发病进程尿液中DTIC含量的监测。同时结合小鼠体重和肿瘤体积,对BA联合DTIC治疗黑色素瘤的效果进行了初步评价,发现BA的摄入会对DTIC利用率产生一定影响。