纳米金修饰电极检测三聚氰胺条件的优化

陈林林,吴嘉树,李 伟,范天娇,韩 可,辛嘉英,2

(1.哈尔滨商业大学，省高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076;2.中国科学院，兰州化学物理研究所，羰基合成与选择氧化国家重点实验室,甘肃兰州 730000)

三聚氰胺(MEL,C3H6N6,1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺)是富氮杂环化合物。它通常用于生产塑料、粘合剂、涂层剂、餐具、泡沫、颜料、胶水和阻燃剂等[1-3]。由于氮含量高,一些食品企业违规将三聚氰胺用于乳制品中,这种方法可以使乳产品通过凯氏定氮法[4]检测时提供较高的氮浓度,以显示其产品中的高蛋白质含量。过量摄入MEL(美国和欧盟为2.5 ppm;在中国,婴儿配方奶粉的浓度为百万分之一)可能会促使肾脏中形成不溶性的MEL氰尿酸盐结晶,最终导致肾功能衰竭甚至死亡[5]。例如,2007～2008年在美国和中国由于乳制品中违法添加三聚氰胺造成的儿童和宠物急性肾脏问题[6]。尽管有严格的规定,一些食品仍含有三聚氰胺[7]。因此,一种简单、灵敏、稳健的检测三聚氰胺含量的方法是所必需的[8-9]。

现有的三聚氰胺测定方法包括:分光光度法[10]、化学发光法[11]、电化学检测法[12]、色谱与UV或质量检测器结合法[13]。在这些方法中,电化学方法简单、成本低、更准确,更易于现场应用。此外,电化学方法为确定许多生物和环境污染物提供了一种灵敏的方法[14-15]。因此,近年来,电化学技术因其强大的应用前景在分析化学领域引起了特别的关注。

甲烷氧化菌素(methanobactin,Mb)是一种小分子荧光肽,在甲烷氧化菌细胞外以分泌物的形式存在,在细胞内则参与颗粒甲烷单加氧酶(pMMO)的组成,并且存在于细胞内膜上[16]。Mb与铜的结合物(Mb-Cu)具有超氧化物歧化酶的活性[17-18]。Mb不仅可以与Cu(Ⅱ)结合,同时也具有螯合 Au(Ⅲ)并将其还原成Au(0)的能力。目前,已采用生物法制备出修饰有Mb的单分散纳米金Mb-AuNPs,该纳米金不仅性质稳定,同时还保持有Mb的生物活性[19-22]。近年来,纳米金被广泛用于三聚氰胺的检测,李萌萌等[23]把 1,4-二硫苏糖醇(DTT)、金纳米粒子、L-半胱氨酸(L-Cys)组装到修饰电极表面,制备了 GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE 复合电极,用来检测三聚氰胺,最低检测浓度为1.0×10-8mol/L。Xin等[20]利用Mb介导纳米金的合成过程中,加入三聚氰胺时,三聚氰胺与Mb的恶唑酮环相互作用,从而中断Au-NPs的形成。三聚氰胺还可以刺激形成的Au-NP聚集。以此来检测三聚氰胺,此方法的最低检出浓度为2.38×10-7mol/L。本实验将与纳米金结合后的Mb(Mb-AuNPs)以混合自组装的方法修饰到裸金电极表面,此修饰物质与传统电极修饰物质相比,易于制备并且对人体无毒害,可用于直接食品检测。此复合电极与三聚氰胺之间产生作用,可以对痕量的三聚氰胺产生响应,以此分析此修饰电极在检测三聚氰胺时的电化学行为。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三聚氰胺 阿拉丁试剂公司;铁氰化钾、亚铁氰化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸 天津市天力化学试剂有限公司;氯金酸 天津市赢达稀贵化学试剂厂;柠檬酸钠 天津市光复精细化工研究所。

BSA224S电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;CHI660E电化学工作站 上海辰华大陆化学试剂厂;HNY-100B恒温培养振荡器 天津市欧诺仪器仪表有限公司;R-20旋转蒸发仪 上海-恒科学仪器有限公司;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;TGL-16高速台式离心机 上海医疗器械六厂;HL-2S恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司;98-1-B型电子调温电热套 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Mb-AuNPs的制备 根据文献[24]进行Mb的制备和分离纯化,并利用Frens法[25]制备出酒红色的AuNPs溶液,将0.11×10-4mol/L Mb加入2 mL AuNPs溶液中,荧光下检测Mb与纳米金的组装结果。

1.2.2 裸金电极的制备 取一个金电极,在制备好的食人鱼溶液(70%浓硫酸与30%过氧化氢混合制成)中浸泡5 min取出,用去离子水冲洗几次,去除表面的食人鱼溶液。金电极(φ=3 mm)分别用粒径为0.25和0.05 μm的氧化铝悬浮液抛光成镜面,然后用甲醇和水超声清洗30 s,从而得到预处理好的裸金电极。

1.2.3 Mb-AuNPs修饰电极纳米金粒径的优化 采用5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]与5×10-3mol/L K4[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl溶液作为电化学测定的交流阻抗法(AC impedance method,EIS)与循环伏安法(CyclicVoltammetry,CV)的测定用溶液。使用已制得的Mb,与平均粒径分别为10.6、14.3、16.8、17.7和20.6 nm粒径的纳米金进行自组装,利用荧光光谱监测组装过程,将结合好的Mb-AuNPs修饰到已经打磨完毕的裸金电极上,以5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]与5×10-3mol/L K4[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl溶液为电化学测定溶液,研究修饰电极的电化学性能。

1.2.4 三聚氰胺在修饰电极上的电化学行为 将0.01 mol/L的三聚氰胺溶液与0.1 mol/L PBS缓冲溶液混合,以此溶液作为检测三聚氰胺的电化学测定溶液,利用循环伏安法分析该电极的电化学行为。

1.2.4.1 PBS溶液对三聚氰胺电化学行为的影响 使用已制得的Mb,与平均粒径为16.8 nm的纳米金进行自组装,利用荧光光谱监测组装过程,将结合好的Mb-AuNPs修饰到已经打磨完毕的裸金电极上。加入的PBS缓冲溶液浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L,考察加入不同浓度的PBS对三聚氰胺体系检测的影响,以确定自组装修饰电极检测三聚氰胺的最优条件。

1.2.4.2 体系pH对三聚氰胺电化学行为的影响 使用1.2.4.1中修饰电极的制备方法制备出Mb-AuNPs修饰电极,加入的PBS缓冲溶液浓度为0.1 mol/L,PBS缓冲溶液pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,考察体系pH对三聚氰胺检测的影响。

1.2.4.3 修饰电极对三聚氰胺的检测 使用已制得的Mb,与粒径为16.8 nm的纳米金进行自组装,利用荧光光谱监测组装过程,将结合好的Mb-AuNPs修饰到已经打磨完毕的裸金电极上,使用pH6.0浓度为0.1 mol/L的PBS缓冲溶液,三聚氰胺浓度分别为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01 mol/L。利用循环伏安法考察Mb-AuNPs电极对不同浓度三聚氰胺的响应性能,根据三聚氰胺浓度与氧化峰电流的关系,绘制得到以三聚氰胺浓度(X)为横坐标,峰电流(Y)为纵坐标标准曲线。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次,不同组的数据使用SPSS 17.0软件采用Duncan’s新复极差检验法进行显著性差异分析,显著性水平P<0.05。使用Origin软件绘图。

2 结果与分析

2.1 Mb与纳米金的组装结果

由图1可知,在275 nm激发波长下,16.8 nm金纳米粒子的最大荧光发射在550 nm处。随着Mb的加入,金纳米粒子的荧光发射强度明显减小,峰位置基本不变,说明金纳米粒子和Mb之间存在强烈的相互作用,从而导致金纳米粒子的荧光发生了猝灭,当Mb加入量达到0.20 mL时,金纳米粒子的荧光发射强度与Mb加入量0.18 mL时相比基本不变。实验中同时考察了10.6、12.7、14.3、17.7、20.6 nm粒径纳米金的结合情况,结果显示,与图1具有相同的趋势与结果。可知Mb与纳米金结合完成。

图1 纳米金中加入Mb后的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectrum after adding Mb to AuNPs

2.2 不同纳米金粒径Mb-AuNPs的电化学性能

向预处理好的裸金电极表面滴加20 μL Mb-AuNPs溶液,避光,置于4 ℃环境下18 h。测试前用去离子水冲洗并用N2吹干,从而得到制备好的修饰电极以进行电化学测定。将平均粒径为10.6、14.3、16.8、17.7和20.6 nm的纳米金分别结合Mb后,采用5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]与5×10-3mol/L K4[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl溶液为测定用溶液,通过交流阻抗与循环伏安分析其电化学性能,结果如图2和图3所示。

图2 修饰电极在测定溶液中的交流阻抗Fig.2 AC impedance of modified electrode in assay solution

图3 修饰电极在测定溶液中的循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammetry of modified electrode in assay solution

由图2所示,经拟合后的阻抗图谱(其中,Z′为实部电阻,Z″为虚部电阻)中的圆弧半径是随着Mb-AuNPs与电极表面修饰效果的增大而增大,而电极电子传递电阻(Rtc)的值与其阻抗图谱中的圆弧半径值相等。裸金电极的Rtc最小,近乎为一条直线,说明此时电极表面光滑,无任何物质修饰。当电极被自组装修饰Mb-AuNPs后,Rtc增大,这是因为自组装在金电极表面的Mb-AuNPs形成了一层有序致密的膜,阻碍电极表面与电解液间的电子传输作用,而随着修饰效果的增加,其电子传递电阻也在增加。图2中各电极的Rtc:Mb-AuNPs(16.8 nm)电极>Mb-AuNPs(17.7 nm)电极>Mb-AuNPs(20.6 nm)电极>Mb-AuNPs(14.3 nm)电极>Mb-AuNPs(10.6 nm)电极。因此,粒径为16.8 nm的纳米金与Mb结合后的Mb-AuNPs与裸金电极的组装效果最佳。

从图3中可以看出,修饰电极的氧化还原峰电流均低于裸电极8.54×10-5A,氧化还原峰电位均高于裸电极0.283 V,这是由于在电极表面有更多的物质阻碍电子传递过程,使氧化还原峰电流不断降低,修饰效果越好,降低越明显。其中Mb-AuNPs(16.8 nm)修饰电极的循环伏安曲线峰电流最低为6.83×10-5A,峰电位最高为0.324 V,说明修饰效果较好。冯春梁等[26]制备的金-普鲁士蓝复合纳米粒子修饰电极,得出当交流阻抗图谱的Rtc最大,循环伏安曲线的峰电流最小时的条件为最佳的修饰条件。李萌萌等[23]制备的1,4-二硫苏糖醇(DTT)、金纳米粒子、L-半胱氨酸(L-Cys)修饰电极,当1,4-二硫苏糖醇(DTT)、金纳米粒子、L-半胱氨酸(L-Cys)修饰到电极表面后,循环伏安曲线的氧化还原峰电流值降低,交流阻抗图谱圆弧半径变小。与本实验具有相似的结果。

2.3 三聚氰胺在修饰电极上的电化学行为

2.3.1 PBS溶液对三聚氰胺电化学行为的影响 由图4可以看出在浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L PBS缓冲溶液的三聚氰胺体系中Mb-AuNPs电极的电化学行为。在三聚氰胺的电化学还原中,在添加PBS溶液的反应体系中,循环伏安曲线峰电流随着PBS溶液浓度的增加而降低。当添加与不添加PBS溶液时,体系有明显的电流响应,峰电流由2.38×10-7A增加到1.51×10-6A,实验结果表明修饰电极检测三聚氰胺需要在PBS体系下进行。当加入0.1～0.5 mol/L PBS溶液时,其对应的循环伏安曲线峰电流值分别为:1.51×10-6、1.46×10-6、1.38×10-6、1.30×10-6、1.24×10-6A。0.1 mol/L PBS缓冲溶液的三聚氰胺体系呈现出了最高的电流响应,因此,选择0.1 mol/L PBS缓冲溶液的三聚氰胺体系用于Mb-AuNPs电极测定三聚氰胺的后续研究。

图4 不同浓度PBS体系检测三聚氰胺的循环伏安图Fig.4 Cyclic voltammetry of melamine detected by different solution ratio systems

2.3.2 体系pH对三聚氰胺电化学行为的影响 由图5可知,在不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的PBS中Mb-AuNPs电极的性能随pH变化。随着检测体系pH的增加,峰电流呈现增加后减小的趋势。在三聚氰胺的这种电化学还原中,各pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)下的循环伏安曲线峰电流分别为1.13×10-6、1.45×10-6、1.51×10-6、1.38×10-6、1.22×10-6A。pH=6.0的检测体系呈现出了最高的电流响应。因此,选择6.0的pH用于Mb-AuNPs电极测定三聚氰胺的后续研究。

图5 不同pH体系检测三聚氰胺的循环伏安图Fig.5 Cyclic voltammetry of melamine detected by different pH systems

2.3.3 修饰电极对三聚氰胺的检测 从图6可知,加入三聚氰胺溶液与未加入三聚氰胺溶液的反应体系中,循环伏安曲线有着明显变化,氧化峰电流由2.12×10-7A增加到1.51×10-6A,氧化峰电位由0.189 V增加到0.243 V。还原峰电流由-5.47×10-7A增加到-1.71×10-6A,还原峰电位由0.02 V增加到0.16 V。加入三聚氰胺溶液后看到了明显的氧化还原峰,试验结果表明,Mb-AuNPs修饰电极在三聚氰胺体系中对三聚氰胺有明显的响应信号。

图6 修饰电极在有无三聚氰胺溶液体系中的循环伏安图Fig.6 Cyclic voltammetry of modified electrode in with or without melamine system

如图7所示,利用Origin软件拟合得到标准曲线为y=0.0909x+0.72233,相关系数r=0.9909,说明在此范围内三聚氰胺浓度与其峰电流呈现出良好的线性关系,满足分析要求。采用三倍信噪比计算其最低检测限为0.384×10-8mol/L与李萌萌等[23]和杨晓蕊等[27]文献得出的结果相比,均低于其检出限。

图7 三聚氰胺标准曲线Fig.7 Standard curve of melamine

2.3.4 重现性与稳定性 使用同一根Mb-AuNPs电极测定三聚氰胺样品溶液,重复测定10次,所得结果如表1所示,平均峰电流为1.549×10-6A,相对标准偏差RSD为0.75%,表明该电极具有良好的重现性。再将制备好的电极在空气中放置7 d,然后进行检测。峰电流为1.457×10-6A,与刚制备好的电极峰电流相比无显著性差异(P<0.05),表明该修饰电极的稳定性良好,使用寿命长,可以进行实际应用。

表1 重现性试验结果Table 1 Reproducible test results

2.3.5 干扰实验 研究了在该三聚氰胺定量过程中普通无机离子以及有机化合物可能的干扰作用。结果表明,500倍的常见无机盐NaCl、KNO3,100倍的葡萄糖和尿素等在该三聚氰胺(0.01 mol/L)测定中具有可忽略的干扰效应(干扰<±5%)。

3 结论

通过电化学循环伏安法和交流阻抗法对修饰电极的性能以及三聚氰胺在修饰电极上的电化学行为分析得出,以16.8 nm的纳米金制备出的Mb-AuNPs电极电化学性能最好,在PBS浓度为0.1 mol/L、PBS溶液pH为6.0时,该修饰电极在检测此三聚氰胺体系时得到最高的电化学信号。该电极制备简单,检测效果好,最低检出限为0.384×10-8mol/L,相对标准偏差(RSD)为0.75%,并且该电极具有理想的重现性与稳定性,为实际样品的检测提供理论依据。