香芋皮多酚的超声提取工艺优化及其抗氧化活性

陈 嫣,段振华,*,刘 艳,段秋霞,唐美玲,段伟文,唐小闲

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034;2.贺州学院食品与生物工程学院,广西贺州 542899)

香芋(Colocasiaesculenta)又名地栗子、槟榔芋,属天南星科魁芋属植物,是热带潮湿地区普遍种植的根茎类经济作物,既可食用又可药用,含有丰富的淀粉、蛋白质、膳食纤维、维生素、矿物质等营养成分,还含有多糖、酚类等活性物质,具有增强免疫力、抗氧化、健胃清肠、抗肿瘤和降血脂等功效[1-2]。我国南方特别是广西地区香芋资源极丰富,且销售价格低廉,可作为辅料加入食品,如广西特色香芋扣肉,也可直接对其进行加工,广泛用于面包、蛋糕、脆片、冰淇淋、固体饮料、酸奶、调味品等食品中[3]。近年来随着香芋加工不断发展,香芋在加工过程中会产生大量的副产物[4],主要是香芋皮。工厂很少对香芋皮进行利用,大多数将其当成肥料,有些甚至丢弃,这直接影响了香芋的加工利用率,造成资源浪费。目前对香芋副产物香芋皮的研究甚少,陈秋娟等[5-7]研究了改性香芋皮粉末对Cr(Ⅵ)、Cu(Ⅱ)、Pb2+的吸附性能,将香芋皮应用于吸附废水中的重金属离子,对改善环境有着积极的影响;施帅等[8]研究微波辅助提取芋头生物碱工艺,但并没有深入研究芋头皮生物碱的作用;朱宪龙等[9]用超声波辅助提取槟榔芋皮的生物碱并研究其抑菌性质。研究表明在香芋皮中发现的活性成分为生物碱,而香芋皮中其他的组成成分尚未有文献详细报道,值得深入研究。因此研究香芋皮中的活性成分及其作用对香芋副产物的利用有重要意义。

香芋皮中生物碱的提取为香芋皮活性成分的提取提供了一定的参考。虽然香芋皮中其他活性成分的提取未见报道,但多酚在多种植物中广泛存在,且植物中皮、根、叶和果等部位中大都含有植物多酚[10]。王佳宏[11]的研究也表明了芋头中含有较多的多酚类物质,特别是近周皮部位。多酚类成分在抗氧化方面有着良好的效果,它可以有效的清除人体产生的自由基,以达到抗氧化、延缓衰老的目的,是安全有效的天然抗氧化剂[12-15],但目前尚未见到从香芋皮中提取多酚的研究。本文利用超声波所产生的空化和热效应等特殊作用,能将多酚快速高效地提取出来[16-18]。因此本研究以香芋加工副产物香芋皮为原料,采用超声辅助提取香芋皮多酚,并对抗氧化活性进行研究,有助于揭示香芋皮具有的保健功能,为香芋副产物活性物质的利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香芋 购于贺州百家福超市;磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、六水合三氯化铁、无水乙醇、抗坏血酸 分析纯,广东光华科技股份有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼自由基 分析纯,梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐 生物试剂,合肥博美生物科技有限公司;福林酚 生物试剂,上海源叶生物科技有限公司;无水碳酸钠 分析纯,西陇科学股份有限公司;没食子酸、三氯乙酸、铁氰化钾 分析纯,天津大茂化学试剂厂;过硫酸钾 分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司。

PTX-FA110S电子天平 福州华志科学仪器有限公司;HH-S2数显恒温水浴锅 江苏金怡仪器科技有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵 河南省予华仪器有限公司;DFY-600摇摆式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司;DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;RE311旋转蒸发仪 日本雅马拓(YAMATO);XH-300B微波超声组合萃取仪 北京祥鹄科技有限公司;UV-1780紫外可见分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 香芋皮多酚的提取工艺 将购买的香芋洗净,用削皮刀削皮,厚度在1～2 mm,收集废弃香芋皮放在60 ℃干燥箱中恒温烘干,粉碎后过60目筛,贮于干燥避光处备用。按照一定料液比,精密称取香芋皮粉末1.000 g,按照工艺研究中的不同参数设定超声提取条件进行多酚的提取,离心,上清液即为多酚溶液。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 超声功率对香芋皮多酚得率的影响 称取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,设定乙醇浓度为70%,料液比为1∶30 g/mL,提取时间为20 min,分别在100、200、300、400、500 W超声功率的条件下进行提取,平行试验三次,考察不同超声功率对香芋皮多酚得率的影响,确定较佳超声功率。

1.2.2.2 乙醇浓度对香芋皮多酚得率的影响 称取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,设定超声功率400 W,料液比为1∶30 g/mL,提取时间为20 min,分别在30%、40%、50%、60%、70%乙醇浓度的条件下进行提取,平行试验三次,考察不同乙醇浓度对香芋皮多酚得率的影响,确定较佳乙醇浓度。

1.2.2.3 料液比对香芋皮多酚得率的影响 称取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,设定超声功率400 W,乙醇浓度50%,提取时间20 min,分别在1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL料液比的条件下进行提取,平行试验三次,考察不同料液比对香芋皮多酚得率的影响,确定较佳料液比。

1.2.2.4 超声时间对香芋皮多酚得率的影响 称取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,设定超声功率400 W,乙醇浓度50%,料液比1∶50 g/mL,分别在10、20、30、40、50 min超声时间的条件下进行提取,平行试验三次,考察不同超声时间对香芋皮多酚得率的影响,确定较佳超声时间。

1.2.3 正交试验 在单因素试验的基础上,为了多方面的分析不同因素间的相互作用对超声辅助提取香芋皮多酚的影响,根据单因素试验得到的结果选择正交表L9(34)对香芋皮中多酚的提取工艺进行优化研究,正交试验因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 香芋皮多酚得率的测定

1.2.4.1 没食子酸标准曲线的建立 参照文献[19]的方法,略作修改。精确称取0.2500 g没食子酸标准品,用蒸馏水溶解并定容到50 mL棕色容量瓶中,取1 mL用蒸馏水定容到100 mL,得到质量浓度为50 μg/mL的没食子酸标准溶液。分别移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的没食子酸标准溶液置于8个10 mL容量瓶中,再分别加入2 mL福林酚试剂,振荡摇匀,在0.5～8 min内加入2.5 mL 12% Na2CO3溶液,反应30 s后用蒸馏水定容,室温避光反应2 h,用蒸馏水作空白对照,在765 nm下测定其吸光值。以吸光值为纵坐标,没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线,得到没食子酸在浓度0～7 μg/mL内与其吸光值呈良好的线性关系,得到线性回归方程y=0.13112x+0.00772,相关系数R2=0.9994。

1.2.4.2 多酚得率计算 精密量取提取液0.1 mL于10 mL容量瓶中,按1.2.4.1所述的方法测定提取液的吸光值,将吸光值代入标准曲线方程中,计算出样品液中多酚的浓度,代入下式中计算出1.000 g香芋皮粉末中多酚类物质的含量(以没食子酸计,mg/g),计算公式如式(1)所示。

式(1)

式中:X表示香芋皮多酚得率,mg/g;C表示样品液中多酚的浓度,μg/mL;V表示提取液的总体积,mL;m表示称取的香芋皮粉的质量,g。

1.2.5 抗氧化活性测定 将1.2.1提取出多酚溶液旋转蒸发浓缩后测定其浓度,最后稀释成适当浓度进行抗氧化活性测定。

1.2.5.1 总还原能力的测定 参照文献[20]测定2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 μg/mL的香芋皮多酚、VC和没食子酸溶液在700 nm处的吸光度值,吸光度值越高表明其总还原能力越强。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率的测定 参照文献[21]在517 nm处测定0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 μg/mL的香芋皮多酚、VC和没食子酸溶液对DPPH自由基的清除能力,计算清除率。计算公式见式(2)。

式(2)

式中:Ai表示2.0 mL样品液与2.0 mL 0.02 mmol/L DPPH溶液的吸光度值;Aj表示2.0 mL样品液与2.0 mL无水乙醇的吸光度值;A0表示2.0 mL 0.02 mmol/L DPPH溶液与2.0 mL无水乙醇的吸光度值。

1.2.5.3 ABTS自由基清除率测定 参照文献[22]在734 nm处测定0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL的香芋皮多酚、VC和没食子酸溶液对ABTS自由基的清除能力,计算清除率。计算公式见式(3)。

式(3)

式中:Ai表示0.1 mL样品液与3.9 mL ABTS溶液的吸光度值;Aj表示0.1 mL样品液与3.9 mL 10 mmol/L磷酸缓冲溶液的吸光度值;A0表示0.1 mL 10 mmol/L磷酸缓冲液与3.9 mL ABTS溶液的吸光度值。

1.3 数据处理

所有样品均设3个重复实验操作,运用Origin 8.5和SPSS 20.0软件进行数据处理分析和图形绘制,测定结果以平均值±标准差表示。根据IC50来判断其抗氧化能力,IC50值越小,样品抗氧化活性越强[23]。IC50的定义为:使得自由基的清除率达到50%时需要的样品液的浓度,通过SPSS 20.0求出IC50。

2 结果与分析

2.1 超声功率对香芋皮多酚得率的影响

由图1知,在超声功率100～200 W范围时,超声波功率对香芋皮多酚得率的影响不大,这是因为小功率范围内超声波产生的热效应和能量较小,不能有效破坏组织细胞,功率在200 W以下时对多酚得率几乎无影响。超声功率从200 W提升至400 W时,香芋皮多酚得率逐渐提高,在400 W时达到最大值。超声功率继续增大时,多酚得率开始下降,这主要是由于超声功率增加,超声波产生的热效应使体系温度升高,促使细胞破裂,分子扩散、渗透和溶解速度加快,有利于多酚物质的浸出[24],但功率过大时会使多酚结构破坏,杂质溶出过多,使多酚得率降低[25]。综合节约能耗和提高多酚得率的角度考虑,选取350、400、450 W的超声功率为正交试验筛选水平范围。

图1 超声功率对香芋皮多酚得率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.2 乙醇浓度对香芋皮多酚得率的影响

由图2可知,乙醇浓度对多酚提取效果影响较大,整体呈现先上升后下降的趋势,当乙醇浓度为50%时得率达到最大值,乙醇浓度超过50%后,香芋皮多酚得率开始迅速下降,这可能是由于香芋皮中存的多酚与50%乙醇极性相同,有机溶剂与水的混合液可以打断多酚类物质-蛋白质(多糖)复合物的结合键,从而释放多酚物质[26]。但高浓度乙醇使细胞膜变性,导致多酚不能很好的溶解出来[27],另外一些醇溶性杂质的溶出也会与多酚竞争与乙醇结合,造成多酚含量降低。综合节约能耗和提高多酚得率的角度考虑,选取45%、50%、55%的乙醇浓度为正交试验筛选水平范围。

图2 乙醇浓度对香芋皮多酚得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.3 料液比对香芋皮多酚得率的影响

由图3可知,随着料液比增大,香芋多酚得率呈逐渐上升趋势,当料液比到达1∶50 g/mL时出现峰值,之后趋于平缓。这是因为料液比过低,溶液已经达到饱和状态,不利于提取物溶出,提取不完全。料液比的不断增加,增大了香芋皮粉末与溶剂的接触面积,增大细胞壁内外的物质的扩散速度,加快了多酚的溶出[28],但由于在一定质量的香芋皮粉里所含的多酚类物质有限,所以在料液比1∶50 g/mL之后多酚在溶剂中的得率达到饱和状态,再加大料液比并不能显著提高多酚的得率,而且耗费溶剂量变多,也会造成浪费。综合节约能耗和提高多酚得率的角度考虑,选取1∶45、1∶50、1∶55 g/mL的料液比为正交试验筛选水平范围。

图3 料液比对香芋皮多酚得率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.4 超声时间对香芋皮多酚得率的影响

由图4可知,在小于30 min时,多酚得率呈上升的趋势,这是由于超声波独具的物理性质能够促使植物细胞组织破壁或变形,使多酚物质溶出,但提取时间短会导致提取不充分,提取30 min时香芋皮多酚的得率达到最佳。当时间超过30 min时,随着时间增长,超声波产生的热效应逐渐累积[29],强烈的热效应会使分子结构发生改变,时间过长也会使多酚类物质被氧化分解[30],导致多酚得率下降。综合节约能耗和提高多酚得率的角度考虑,选取25、30、35 min超声时间为正交试验筛选水平范围。

图4 超声时间对香芋皮多酚得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.5 正交试验结果

在单因素试验的基础上,选择超声功率、乙醇浓度、料液比、超声时间4个因素进行L9(34)正交试验,以确定提取香芋皮多酚的最优工艺条件。正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2中R1、R2、R3、R4可知4个因素对香芋皮多酚得率的影响程度依次为:B(乙醇浓度)>C(料液比)>A(超声功率)>D(超声时间),即最显著的影响因素是乙醇浓度,超声时间的影响最不显著。正交试验得到香芋皮多酚得率的最佳提取工艺组合为A2B1C3D3,即超声功率400 W,乙醇浓度45%,料液比1∶55 g/mL,超声时间35 min。

2.6 验证试验

由于最佳组合没有在正交表的组合中,所以按照k值计算法得到的最佳组合A2B1C3D3做验证试验,在该工艺下进行五次平行试验得到平均值为(23.61±0.36) mg/g,相对标准偏差为1.54%。验证试验所得结果均优于正交试验表中任意一个组合的得率,说明经正交试验优化得到的提取工艺组合较为可靠。

2.7 抗氧化活性测定试验结果

2.7.1 总还原能力的测定结果 由图5可知,在试验浓度范围内香芋皮多酚的总还原能力随着浓度的增加而增强,存在良好的线性关系和剂量-效应关系[31],当浓度为20.0 μg/mL时香芋皮多酚的还原能力为0.4431±0.0027。在所测定的质量浓度范围内,可以看出香芋皮多酚的总还原能力略高于VC,但明显低于没食子酸。

图5 还原能力试验结果Fig.5 Results of reduction capacity

2.7.2 DPPH自由基清除率的测定 由图6可知,香芋皮多酚、VC和没食子酸在较低的浓度范围就有很好的DPPH自由基清除能力,并随着浓度的增大而增强,香芋皮多酚在浓度小于12.5 μg/mL时与DPPH自由基的清除率呈现良好的线性关系,当浓度达到12.5 μg/mL之后变化趋于缓慢,IC50为(5.6647±0.2545) μg/mL;VC在浓度小于15.0 μg/mL时与DPPH自由基的清除率呈现良好的线性关系,浓度达到15.0 μg/mL之后变化趋于缓慢直至基本不变,IC50为(6.9018±0.0470) μg/mL;没食子酸在浓度小于5.0 μg/mL时与DPPH自由基的清除率呈现线性关系,大于5.0 μg/mL时变化趋于缓慢直至基本不变,IC50为(1.6843±0.2025) μg/mL。由IC50大小判断出香芋皮多酚DPPH自由基清除率高于VC但是远小于没食子酸。在20.0 μg/mL时香芋皮多酚、VC和没食子酸的DPPH清除率达到87.7179%±0.1419%、93.7033%±0.1130%和93.7192%±0.1132%,综合IC50值可以得出,香芋皮多酚对DPPH自由基有较好的清除效果。

图6 DPPH自由基清除试验结果Fig.6 Results of DPPH free radical scavenging capacity

2.7.3 ABTS自由基清除率测定 由图7可知,香芋皮多酚、VC和没食子酸对ABTS自由基的清除能力都是随着底物浓度的增大而增强,香芋皮多酚、VC和没食子酸分别在浓度小于100、160、40 μg/mL时与ABTS自由基的清除率呈现良好的线性关系,之后变化趋于缓慢基本不变。计算出IC50分别为(36.3630±2.4013)、(61.6051±0.9560)、(14.5621±0.1483) μg/mL,由IC50判断出ABTS自由基的清除率大小顺序为没食子酸>香芋皮多酚>VC。在160 μg/mL时香芋皮多酚、VC和没食子酸的ABTS清除率均达到99%以上,无显著差异。香芋皮多酚ABTS自由基清除率最大可达到99.8242%±0.0718%。综上,香芋皮多酚对ABTS自由基有较好的清除能力。

图7 ABTS自由基清除试验Fig.7 Results of ABTS free radical scavenging capacity

3 结论

本试验对提取香芋皮多酚的工艺条件进行了优化,影响香芋皮多酚得率主次因素依次为:乙醇浓度>料液比>超声功率>超声时间,其中最显著的影响因素是乙醇浓度;超声提取香芋皮中多酚的最佳工艺条件为超声功率400 W,乙醇浓度45%,料液比1∶55 g/mL,超声时间35 min,此条件下香芋皮中多酚得率达到(23.61±0.36) mg/g。

抗氧化活性实验表明,在最佳条件下提取得到的香芋皮多酚具有一定的还原能力,对DPPH自由基和ABTS自由基清除作用均表现出良好的清除效果,相应的IC50值分别为(5.6647±0.2545)和(36.3630±2.4013) μg/mL。