Nrf2信号通路在炎症性肠病中的研究进展

柳小曼 陈颖伟,2*

上海交通大学医学院附属新华医院消化内科1(200092) 上海市小儿消化与营养重点实验室2

核因子-红血球相关因子-2(nuclear factor-erythroid 2 related factor-2, Nrf2)是细胞抗氧化应激程序的主要转录调节因子，为CNC家族成员之一，能协调细胞保护性基因的激活，从而防御外源性应力和氧化应激[1]。炎症性肠病(IBD)为基因易感个体在环境因素作用下发生肠道微生态紊乱、免疫功能失调、肠屏障损伤而诱发的慢性非特异性炎性疾病，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。IBD易复发迁延且并发症多见，具有发展为肠纤维化和结直肠癌(CRC)的高风险。多项研究证实Nrf2通路与IBD肠纤维化和癌变关系密切，以Nrf2信号通路为靶点的治疗药物被广泛研究。本文就Nrf2信号通路在IBD中的研究进展作一综述。

一、Nrf2概述

1. Nrf2基本结构和激活：Nrf2是含碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构的转录因子CNC亚家族成员之一，与Nrf1、Nrf3、NF-E2p45亚基协同调控基因表达。Nrf2含7个不同功能同源域(Neh1～7)，非应激稳态时，负性调节因子Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)在胞质结合Neh2区域并通过Cullin3泛素E3连接酶(Cul3/E3)复合体诱导Nrf2持续泛素化降解，使其具有高代谢性并维持极低的表达水平[2]。应激或生理状态下线粒体、过氧化酶体以及内质网代谢产生大量自由基、活性氧簇(ROS)时，Keap1反应性半胱氨酸残基氧化失活，Nrf2与Keap1解偶联并激活磷酸化，入核与小Maf家族成员异二聚化后通过Neh1区结合靶基因启动子区的抗氧化反应元件(ARE)，启动靶基因转录[1-2]。

2. Nrf2-Keap1/ARE通路的功能：Nrf2/ARE通路在维持细胞氧化还原稳态方面发挥重要作用。该通路可调控谷胱甘肽和硫氧还蛋白抗氧化系统关键组分的表达，参与内外源代谢产物的Ⅰ期、Ⅱ期解毒，调节还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生和血红素代谢，同时亦与许多肿瘤、炎性疾病、神经退行性疾病密切相关，已成为新型治疗靶点。此外，近年研究[1,3-4]发现了Nrf2通路的其他功能：调节线粒体生物能学、促进未折叠蛋白反应、调控肠道炎症和肠上皮紧密连接蛋白表达等。

二、Nrf2与IBD

1. Nrf2有助于维持肠上皮屏障：①Nrf2抑制氧化应激降低肠道炎症：ROS能通过氧化应激或促进炎症，损伤肠黏膜细胞[5]。Nrf2激活能显著抑制ROS产生，减轻炎症反应，促进细胞存活，改善肠上皮细胞氧化还原和炎症状态。葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的Nrf2-/-小鼠的促炎因子水平和肠道炎症程度显著高于野生型小鼠[6]。激活Nrf2及其下游多种抗氧化酶表达，可有效减轻猪空肠上皮细胞氧化应激模型的肠上皮损伤和凋亡，并改善肠道黏膜屏障通透性，证实Nrf2能抑制氧化应激，降低肠道炎症[7]。

②Nrf2与自噬交叉调控肠道氧化应激：p62蛋白位于自噬体形成位点，与自噬定位蛋白LC3和泛素化蛋白结合参与自噬过程，剪切p62蛋白pre-mRNA的Keap1相互作用域能显著提高Keap1含量，增强Nrf2泛素化，抑制其靶基因表达[8]。Keap1基因消融则可促使泛素聚集体积累以及自噬激活障碍，说明Keap1-p62结合体亦参与泛素化蛋白降解过程[9]。因此，细胞内各种自噬网络和抗氧化应激过程可通过p62-Keap1相互调节。Harada等[10]的研究显示，自噬缺陷能激活Nrf2/Keap1/血红素加氧酶1(HO-1)通路，减轻吲哚美辛诱导的小鼠肠上皮损伤，说明病理生理条件下，上述两种途径可通过相互协调来维持肠道屏障正常功能。

③Nrf2调节肠道免疫：Th1/Th2细胞分化是宿主肠道免疫防御的关键过程，该分化失调亦是IBD的发病机制之一。有研究[11]通过分析Th1/Th2细胞因子变化推测Nrf2激活剂特丁基对苯二酚(TBHQ)有促使CD4+T细胞向Th2细胞分化的倾向。但部分T细胞分泌细胞因子独立于Nrf2途径，仅通过检测细胞因子变化判断T细胞分化的准确性较低，不同类型的Nrf2激活剂对T细胞的影响亦不尽相同。因此，Nrf2对肠道免疫的影响仍有待进一步深入研究。

④Nrf2影响肠道紧密连接蛋白和肠上皮细胞凋亡，调节肠道通透性：研究[12-13]显示细胞外信号调节激酶(ERK)/Nrf2/HO-1信号通路可介导线粒体自噬而减轻肠道氧化应激所致的上皮损伤，并上调肠上皮间紧密连接蛋白表达，而自噬激活剂或抑制剂亦能改变紧密连接蛋白含量。此外，Nrf2通路激活亦能抑制肠上皮细胞凋亡和肠干细胞过度增殖[14]。

2. Nrf2调控肠道纤维化：多项研究[15-17]显示Nrf2在多种器官中发挥抗纤维化作用，且此种保护作用与纤维化经典通路转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads密切相关。纤维狭窄性CD和肠纤维化动物模型中主要促纤维化因子TGF-β1及其受体均高表达，可向下游Smads蛋白家族传递信号，促进 细胞外基质蛋白沉积和成纤维细胞转化，从而加速纤维化[18]。TGF-β1能增加ROS产生并抑制抗氧化酶，导致氧化还原平衡失调，反之ROS亦为激活TGF-β1/Smads通路的重要介质。因此，Nrf2通路失调所致氧化还原紊乱能通过大量产生ROS，激活TGF-β1/Smads通路，从而诱导纤维化的发生[19]。Guan等[20]用TBHQ处理小鼠慢性纤维结肠炎模型、用TBHQ或SiNrf2预处理人肠成纤维细胞后，采用TGF-β1刺激转化，通过检测纤维化指标和胞内ROS水平表明，TBHQ能通过抑制TGF-β1/Smads信号通路减轻小鼠结肠炎和人肠成纤维细胞纤维化，而Nrf2-/-可促进TGF-β1诱导的肠成纤维细胞分化。因此，Nrf2在体内外均能通过ROS/TGF-β1/Smads途径抑制肠纤维化进程。

3. Nrf2参与IBD癌变转化过程：CRC与IBD(尤其UC)关系确切，IBD患者CRC患病率是普通人群的2～6倍，IBD患者CRC发生率随确诊年限增加而增高[21]。炎症状态下细胞因子、趋化因子、炎性细胞共同组成的富含ROS的复杂微环境是促进IBD炎癌转变的主要因素[22]。作为细胞防御与生存信号转导的经典通路，Nrf2在肿瘤中的角色一直备受关注。目前认为，Nrf2在恶性肿瘤发生、发展中扮演双重且有争议的角色[23]。

①Nrf2在CRC发生早期具有保护作用：Khor等[24]的研究发现，与DSS诱导的野生型小鼠相比，DSS诱导的Nrf2-/-小鼠肠道炎症程度更重，患CRC风险更高，表明Nrf2参与炎症相关CRC的保护作用，且雌激素(E2)对CRC的保护作用亦可能通过Nrf2信号网络实现。外源性E2可降低卵巢切除小鼠的炎性介质水平，上调雌激素受体β(ERβ)，同时使Nrf2及其相关抗氧化酶表达增加[25]。Yokoo等[26]的研究发现，Nrf2启动子区的单核苷酸多态性(SNP)与高癌变风险有关。Nrf2-/-小鼠较野生型小鼠的肿瘤前损害和肿瘤发生率显著提高，且小鼠上皮DNA中8-羟基脱氧鸟苷(DNA氧化损伤标志物)水平明显高于Nrf2+/+小鼠。由此推测，识别能维持Nrf2恒定状态的分子有助于早期预防癌症发展。

②Nrf2在肿瘤晚期参与癌细胞增殖、转移以及放化疗抵抗：以往Nrf2因其防御功能被认定为肿瘤抑制因子，然而越来越多的证据显示Nrf2通路过度激活有利于肿瘤细胞生存，可保护其免受氧化应激和药物作用。目前认为Nrf2在肿瘤晚期可加速肿瘤进展，促进转移，参与放化疗抵抗[27]。

Homma等[28]使用3种Nrf2不同活化程度的人肺癌细胞株进行实验，结果显示A549(Nrf2高度活性)细胞对顺铂的耐药性明显高于NCI-H292(Nrf2中度活性)和LC-AI(未刺激状态下Nrf2不激活)细胞，Nrf2-siRNA可有效抑制A549顺铂耐药和细胞增殖。Zhang等[29]首次发现一种Nrf2去泛素化酶3(deubiquitinase 3, DUB3)能降低Nrf2泛素化，从而促进Nrf2的稳定性和转录活性。值得注意的是，DUB3异位表达会导致Nrf2依赖性肿瘤细胞耐药。有研究[30]从Nrf2亚细胞定位角度探讨其与CRC的相关性。在醌氧化还原酶1(NQO1)和HO-1阳性的结肠肿瘤组织中，Nrf2仅在核内表达(nNrf2)，而在NQO-1、HO-1阴性肿瘤组织中，Nrf2表达局限于胞质(cNrf2)。cNrf2肿瘤患者整体生存率低于nNrf2患者，且能上调蛋白酶体复合物组装关键酶26S蛋白酶体非ATPase调节亚基4(PSMD4)促进肿瘤侵袭性，而PSMD4通过p53降解，增加染色体区域稳定蛋白1(CRM1)表达、促进Nrf2核输出，表明Nrf2/PSMD4共同参与CRC进展。Cheng等[31]的研究显示，cNrf2在体外(HCT116细胞株)和体内(CRC动物模型)均对5-氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂耐药，其机制与PSMD4促使Nrf2核输出，最终激活NF-κB/AKT/β-catenin瀑布有关，进一步证明了上述结论。此外，cNrf2和PSMD4阳性的CRC患者的化疗耐药率更高。

三、以 Nrf2为靶点的IBD治疗进展

Nrf2与IBD的发生发展、肠纤维化、CRC联系紧密。在IBD早期阶段，用Nrf2激活剂维持其稳定水平或能限制IBD进展以及并发症的形成。近年研究[32]显示，小檗碱可改善DSS诱导的结肠炎症状，减轻炎性标志物表达，并以剂量时间依赖方式活化人结直肠腺癌细胞株Caco-2的Nrf2基因，提示Nrf2上调可能与小檗碱治疗IBD的机制有关。其他天然化合物如高良姜黄素[33]、夹竹桃麻素[34]等能通过Nrf2信号通路缓解实验性结肠炎的炎症程度和纤维化。但相关治疗措施目前仅限于实验研究阶段，其在临床治疗中的有效性和安全性有待证实。

另一方面，鉴于Nrf2在癌症晚期过表达，Nrf2抑制剂可能是一种有效的辅助药物。以黄酮类、生物碱为代表的植物提取物以及二甲双胍等化学药物作为Nrf2抑制剂均被考虑用于CRC辅助治疗。体外研究[35]显示,Nrf2抑制剂Brusatol和Nrf2 siRNA均能降低结肠癌细胞活力，增强对伊立替康(结肠癌治疗药物)的敏感性，皮下注射Brusatol能有效抑制移植CRC小鼠肿瘤生长，证实了Nrf2靶点的有效性。而二甲双胍作为一种抗糖尿病药物的同时亦具有抗癌作用。在IBD治疗中，二甲双胍不仅可改善肠道菌群种类和丰度，调节肠道黏膜免疫，改善黏膜屏障，近年研究[36]亦证实了其预防癌症进展的可能性。二甲双胍能以剂量时间依赖方式促进结肠癌细胞株HT29凋亡和自噬，并伴随Nrf2和NF-κB的转录激活，提示二甲双胍有望作为预防和治疗CRC的有效药物 。

四、总结和展望

综上所述，IBD作为临床难治性疾病常伴随严重的并发症，危害患者身心健康，且目前尚无根治方案，因此限制IBD进展以及肠纤维化、肿瘤等并发症的发生至关重要。Nrf2是细胞对抗外部压力的主要保护性分子，具有抗氧化应激、抑制炎症的作用，参与IBD的发生、发展。尽管目前Nrf2在IBD中作用的研究已取得诸多进展，但以Nrf2为中心的具体信号通路仍尚未完全阐明，需更多研究明确其对肿瘤正、负面作用的界限，建立靶向Nrf2治疗的精确依据。同时，研发以Nrf2为靶点的药物，在疾病的不同发展阶段严格调控该分子水平，亦为未来IBD的治疗提供了一条新途径。