二次玻璃化冻融胚胎对临床妊娠结局的影响

周学亮 毛玉玲 杜红姿 陈仕萍

广州医科大学附属第三医院生殖医学中心（广州510150）

胚胎的冷冻解冻，可以帮助选择合适移植胚胎、降低多胎妊娠风险、提高单次取卵的累积妊娠率、减轻促排周期中卵巢过度刺激综合征（OHSS）患者的反应，在供卵、生育力保存方面有重要意义［1］，已成为生殖中心的常规技术选择。

胚胎冷冻通常经历一次冻融即可移植回母体，但也有少数胚胎因特殊情况经历两次冻融。同时，随着囊胚培养技术的不断发展，以及在临床的广泛应用，二次冻融的情况也时有发生，但目前对于胚胎经历二次冻融，是否会降低胚胎的发育潜能、长期安全性还有待商榷，针对二次冻融对妊娠结局影响的研究较少，尽管有文献报告一些病例在胚胎二次冻融移植后获得活产［2-10］，但这些案例数量有限，难以确定其安全性。有研究认为相比单次冻融移植，二次冻融并不影响临床妊娠率、着床率［10-11］，有类似研究支持上述观点，二次冻融不影响妊娠率和着床率，但增加流产率［12］。但也有研究发现囊胚二次冻融周期相比单次冻融周期，临床妊娠率显著下降，多次冻融影响胚胎发育潜能［12］。二次冻融对胚胎发育潜能以及临床妊娠结局影响仍存争议，本研究纳入较多（620 例）二次冻融移植周期，较为全面对比双冻与单冻移植周期，为二次冻融的选择提供参考。本研究选取在我院进行胚胎二次冻融后移植的患者进行分组分析，以同期随机选取的非双冻的解冻胚胎周期患者为对照，研究二次冻融对胚胎发育潜能的影响及探讨二次冻融安全性。

1 资料和方法

1.1 一般资料回顾性分析2014年1月至2018年12月在本中心接受解冻囊胚移植周期助孕的患者资料。统计分析二次冻融囊胚组（包括D3 卵裂胚解冻养成囊胚冻回再解冻移植周期和囊胚解冻后冻回再解冻移植周期）和同期单次冻融囊胚的移植周期11 904 例中选取与双冻周期基本资料匹配的1 250 例作为对照，比较囊胚双冻组（620例）和单冻组（1 250 例）的临床妊娠结局和孕产结局（产科结局仅统计2018年8月前移植周期）。所有患者胚胎冷冻、解冻复苏、囊胚培养及移植均签署知情同意书。纳入标准：（1）取卵周期为常规方案，排除微刺激、PPOS、LPS 方案；（2）冷冻解冻方法为玻璃化冷冻解冻；（3）排除二步移植周期；（4）排除解冻卵子周期；（5）女方年龄≤38 岁。

1.2 方法

1.2.1 卵裂期胚胎冷冻冷冻试剂盒使用日本加藤（KITAZATO）公司产品。挑选符合标准的卵裂期胚胎冷冻，正常受精来源，D3 胚胎细胞数≥5，细胞碎片≤20%，卵裂球大小均一或轻度不均可进行冷冻。将卵裂胚置于ES 液平衡5 ～10 min，后转移至VS 液平衡45 ～60 s，迅速置于载体，投入液氮。

1.2.2 囊胚冷冻挑选符合形态标准的囊胚冷冻，囊胚分级评分采用Gardner 标准，以数字1 ～6评价囊腔扩张状态、以字母A/B/C 评价内细胞团和滋养层细胞发育情况，D5 囊胚评分3BB 及以上，D6 囊胚评分为4CB/4BC 及以上进行冷冻。冷冻前激光辅助皱缩囊腔，待囊腔皱缩后置于ES 液平衡2 ～3 min，后转移至VS 液平衡45 ～60 s，迅速置于载体，投入液氮。

1.2.3 卵裂期胚胎、囊胚复苏解冻试剂盒使用日本加藤（KITAZATO）公司产品。解冻液WS1 提前分装到井字皿中央孔，37 ℃不通气培养箱中预热，解冻液WS2、WS3、WS4、WS4 按序分装到四孔板中，平衡至室温。解冻时将冷冻载体从液氮取出，将装有载体部分迅速置于WS1 液，轻晃至胚胎脱落，平衡约1 min 后依次转移至WS2、WS3、WS4、WS4 液，依次平衡3 min。超过50%的卵裂球存活视为卵裂胚复苏成功。囊胚解冻后培养2 h，囊腔重新扩张至正常形态且内细胞团和滋养层细胞均存活视为囊胚复苏成功。解冻胚胎培养约2～5 h 后移植。

1.2.4 超排卵方案及受精根据我中心促排方案依患者情况选定，解冻周期冻胚移植内膜准备按本中心临床技术规范执行。根据取卵日男方精子质量决定行常规体外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵胞浆内单精子注射术（Intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI），胚胎培养按本中心实验室技术操作规范（SOP）执行。

1.2.5 移植胚胎及妊娠随访胚胎移植，在经腹B 超引导下，将解冻复苏胚胎移植到患者宫腔中上段，移植后内外管交由实验室工作人员检查无胚胎残留为移植成功。移植后第14 d 进行血清β-HCG 测定，若β-HCG≥25 IU/L，则为生化妊娠。移植后28 d 进行经阴道B 超检查，若观察到妊娠囊则为临床妊娠。此后定期B 超监测随访。确认临床妊娠后，孕12 周内自然流产定义为早期流产，孕28 周内自然流产定义为流产，孕＜37 周分娩定义为早产。体质量＜2 500 g 定义为为低出生体重儿，＜1 500 g 定义为极低出生体重儿。

1.3 统计学方法采用SPSS 21.0 进行数据处理，呈正态分布数据以均数± 标准差表示，采用两独立样本t检验；非正态分布数据采用M（P25，P75）表示，采用Mann-Whitney′sU检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料对比两组的基线特征，单冻组和双冻组的女方平均年龄、平均移植胚胎个数、体质量指数、内膜厚度、不孕年限、不孕类型、复苏周期内膜准备方式、内膜转化日内膜厚度差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 解冻移植周期患者的基线特征Tab.1 Baseline characteristics of patients in vitrified-warmed embryo transfer 例（%）

2.2 解冻存活比较单冻组和双冻组囊胚解冻存活率分别为98.8%、98.8%，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。囊胚行辅助孵化率分别为9.0%、8.2%，组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3 临床和孕产结局比较比较两组临床结局，单冻组和双冻组间多胎率、单卵双胎率、早期流产率、流产率、异位妊娠率差异无统计学意义（P＞0.05，表2）；双冻组胚胎着床率（36.9%）显著低于单冻组（50.1%），差异有统计学意义（P＜0.05）；临床妊娠率（43.1%）显著低于单冻组（62.8%），差异有统计学意义（P＜0.05）。对比两组活产结局、早产率、活产率、死产率、平均孕周、出生婴儿平均体质量组间差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

表2 解冻移植周期的临床妊娠结局对比Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes in vitrified-warmed embryo transfer 例（%）

表3 解冻移植周期的婴儿孕产对比Tab.3 Comparison of infant outcomes in vitrified-warmed embryo transfer 例（%）

3 讨论

胚胎冷冻技术是辅助生殖技术（ART）技术的重要组成部分，由于操作简便、胚胎复苏率高、临床妊娠率高等优点［12］，越来越多生殖中心采用玻璃化冷冻胚胎技术。胚胎在冻融过程中会发生冰晶应力、冷休克、溶质效应、破碎效应、重结晶和渗透性休克等冷冻损伤［16］。玻璃化冷冻液含有冷冻保护剂的高渗溶液，常用冷冻剂包括乙二醇、丙二醇、DMSO 和非渗透性保护剂（蔗糖、聚蔗糖等），如DMSO 毒性较高，会与蛋白发生不可逆结合，易导致果糖-1，6-二磷酸酶的功能受损，对细胞产生毒性作用。此外冷冻过程中，随着胞外冰晶的形成，渗透压升高，溶液其他的理化参数如气体溶解指数、黏滞度和pH 等也会发生改变，偏离细胞的生理环境，加重对细胞的损伤。冷冻过程减少冰晶形成尤为重要，在胚胎冷冻降温过程中水会形成冰晶，体积增大破坏细胞骨架结构，改变膜通透性，损伤细胞甚至导致细胞死亡［17-18］。

玻璃化冷冻技术日趋成熟，对卵母细胞［19-20］、卵裂期胚胎、囊胚［21］、卵巢组织［22-23］冻融复苏均取得不错的效果，胚胎复苏存活率可以达到90%以上，被广泛应用于生殖领域。同时，安全性也一直是人们所关注的重点。有研究对比新鲜胚胎移植周期和解冻胚胎移植周期，发现解冻周期的着床率和临床妊娠率显著高于新鲜移植组［24］。也有研究联合多中心随机对照研究显示，与新鲜单囊胚移植比较，全胚冷冻后解冻周期行解冻复苏单囊胚移植可显著提高胚胎着床率、临床妊娠率及活产率，以及单胎新生儿出生体质量，而流产率、其他产科并发症及新生儿发病率与之相似，但同时发现冷冻复苏单囊胚移植的母亲子痫前期风险增加［25］。有Meta 分析发现，解冻周期单胎妊娠的围产风险低于新鲜胚胎移植周期，包括低胎龄儿、低出生体重儿、早产、产前出血、围产期死亡率等风险［26-27］。胚胎的成功着床不仅需要高质量的胚胎，也需要胚胎与子宫内膜的相互作用［28］，解冻周期患者胚胎表现出更好的容受性，与胚胎发育同步性提高，临床结局更好。

冷冻胚胎通常经历单次冻融即可移植，但随着辅助生殖治疗技术的不断进步，临床上逐渐出现二次冻融的囊胚，如：有患者移植当日遇突发因素无法移植，此时胚胎已解冻复苏需二次冻回，待下个解冻周期再复苏移植，即胚胎在被移植前经历两次冷冻、复苏过程，成为双冻胚胎。随着二胎的放开，越来越多曾接受过辅助生殖治疗并有剩余胚胎保存的患者回来接受解冻移植周期治疗，这其中有很多胚胎可能是五六年前甚至十几年前储存的胚胎，当患者剩余胚胎数目足够的情况下（≥3 个），患者经常会选择进行囊胚培养后移植，部分患者移植囊胚后仍有多余的囊胚会被冻回，成为双冻囊胚。有研究发现相比卵裂胚移植，单优囊胚移植显著提高临床妊娠率、种植率，降低多胎率［29］，近年来，减少辅助生殖治疗中多胎妊娠、降低孕产并发症风险，逐渐成为学者关注的重点。在患者条件及胚胎质量适合的情况下，单囊胚移植便成为优先选择或必要选择。尤其在生育二胎的患者中，有很大一部分患者首胎生产方式为剖宫产，这类患者一般会建议选择单胚移植，但此时患者的胚胎往往并非单枚冷冻，在复苏培养移植单囊胚后，剩余一枚冻回囊胚成为双冻囊胚。

目前关于二次玻璃化冻融胚胎安全性研究较少，有研究回顾分析34 例二次冻融周期与同期随机选择的71 例常规单次冻融周期相比较，统计分析发现二次冻融组着床率、临床妊娠率均显著低于单次冻融组，两组的流产率、多胎率、新生儿产科结局比较差异无统计学意义［13］。也有报道患者移植玻璃化双冻胚胎后产下健康胎儿，记录女婴体况并随访至12 岁，身体和智力发育均正常［30］。二次冻融胚胎对临床妊娠、新生儿结局影响仍存在争议，本文旨在探讨分析二次冻融对胚胎发育潜能的影响及探讨二次冻融安全性。

本研究对比单冻组和双冻组囊胚移植妊娠结局，发现多胎妊娠率、单卵双胎率、早期流产率、流产率和异位妊娠率组间差异无统计学意义（P＞0.05），而着床率、临床妊娠率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），与以前研究结果［30］相似，但与另一研究结果［12］有差别，该研究是解冻慢速冷冻D3 冻卵裂期胚胎，与本研究玻璃化解冻D3 胚胎可能对临床妊娠有不同影响。对比两组的新生儿活产情况，早产率、活产率、死产率、分娩孕周和新生儿出生体质量组间差异无统计学意义（P＞0.05），与以前的相关研究结果类似。笔者认为双冻组比单冻组着床率、临床妊娠率显著降低，可能与双冻组的囊胚经过两次玻璃化冻融、冷冻过程中的冷冻损伤、吹吸胚胎的机械损伤、冷冻过程透明带的脱落使囊胚暴露在外界环境等因素对胚胎发育潜能的损害相关。

单囊胚移植是目前国际辅助生殖发展的趋势，它在保证一定妊娠率的同时，极大的降低了多胎率，本中心对符合Day3 可用胚胎数量和质量标准的患者，建议其养成囊胚后再行单囊胚冷冻或移植，尽量避免囊胚双次冻融的发生。

本研究对比双次冻融和单次冻融囊胚移植周期，为双冻囊胚研究提供参考。综上所述，二次冻融在一定程度上会降低囊胚的种植率，但仍有较高的着床妊娠能力，对于双冻囊胚移植仍有43.1%的妊娠率。同时，双冻并未提高如流产、多胎等不良妊娠结局。对于复苏卵裂胚有特殊意外因素不能及时移植的患者，可考虑进行囊胚培养后再进行移植或冷冻。但囊胚培养存在未形成可用囊胚的风险，各中心应根据实际情况，进行选择。本研究探究二次玻璃化冷冻对胚胎发育潜能的影响，为今后胚胎冷冻损伤提供参考。