硫酸右旋糖苷通过下调血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体2表达和M2型巨噬细胞浸润抑制胃癌血管生成的研究

郭嘉欣 李梦琪 尚静 焦龙杏 侯绍章 徐远义 黄允宁

1宁夏医科大学基础医学院病理学系（银川750000）；2宁夏回族自治区人民医院胃肠外科（银川750000）

胃癌患者死亡的主要原因是发生复发和转移，腹腔种植转移是主要形式以及决定预后的主要因素，腹膜是常见的转移部位［1］。胃癌转移到腹腔形成转移灶的过程中，血管生成对微转移灶快速增长至关重要［2］。近年来研究发现，胃癌肿瘤微环境中M2 型巨噬细胞与肿瘤血管生成关系密切，M2 型巨噬细胞通过与血管内皮细胞直接接触或分泌因子促进血管新生［3］。目前对胃癌腹腔转移患者的治疗以全身化疗和腹腔灌注化疗为主，但仍缺乏疗效显著的治疗方案。因此研究组合靶向肿瘤微环境中M2型巨噬细胞及肿瘤血管生成的抗胃癌腹腔种植转移药物具有重要的研究潜力和价值。

硫酸右旋糖苷（dextran sulfate，DS）是一种大分子聚阴离子多糖，分子量为500 000 Da，具有来源广、成本低、易溶性、腹腔吸收慢、毒副作用小的特点，是一种具有腹腔给药优势的药物［4］。课题组前期研究发现DS 可以有效抑制人胃癌细胞的增殖、侵袭迁移和上皮间质转化［5-7］。但DS 是否能影响胃癌微环境中M2 型巨噬细胞以及血管内皮生长因子（VEGF）/血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）的表达进而发挥抗血管生成作用尚不清楚。本实验先通过免疫组织化学和免疫荧光双染分析人胃癌组织中M2 型巨噬细胞和肿瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的关系，再通过动物体内实验研究DS 对M2 型巨噬细胞浸润、胃癌血管生成和VEGF/VEGFR2 表达的影响，以期为DS 抑制胃癌血管生成提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人胃癌标本收集宁夏回族自治区人民医院2018年12月至2019年10月经手术切除、术后病理确诊为胃癌的组织标本34 例，对应癌旁组织标本12 例，所有患者术前均未接受放化疗治疗，不伴有其他恶性肿瘤。

1.1.2 细胞人胃癌细胞BGC-823 购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.1.3 动物实验动物选用购自北京维通利华公司的BALB/c Nude 裸鼠，5 ～7 周龄、雄性、体质量17 ～19 g。动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。裸鼠饲养于宁夏医科大学实验动物中心SPF 级屏障环境内。本研究已通过宁夏医科大学实验动物福利伦理审查委员会批准。

1.1.4 试剂DS（D8906）购于sigma 公司；胎牛血清、RPMI-1640 培养基购自Hyclone 公司；全蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自凯基生物有限公司；DAPI、山羊血清购自北京中杉金桥公司；GAPDH、HIF-1α、VEGFR2抗体均购自Proteintech生物公司；CD34和CD163抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人胃癌细胞BGC-823 培养于含有1%双抗、10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，置于37 ℃、5%CO2无菌培养箱内培养，待细胞融合至85%～90%时传代。

1.2.2 药品配制取0.3 g DS 溶解于99.7 mL 生理盐水中，形成浓度为0.3%的DS 溶液，用0.22 μm 的过滤器过滤灭菌，用于动物实验。

1.2.3 动物模型建立及分组实验前收集对数生长期的BGC-823 细胞，用生理盐水调整细胞密度为5 × 107个/mL 待用。裸鼠共24 只，麻醉后腹部消毒，在剑突下开2 mm 切口，将0.2 mL（1 × 107个细胞）的细胞悬液接种于裸鼠腹腔，缝合切口并揉腹使细胞悬液均匀分布。第二天将裸鼠随机分为DS 组和对照组各12 只，分别向裸鼠腹腔注射0.3%DS 或生理盐水1 mL。于14 d 后处死裸鼠并取出腹腔转移瘤组织，每只裸鼠的组织分为两份，分别放于4%多聚甲醛或-80 ℃冰箱保存，用于后续实验。

1.2.4 免疫组织化学及免疫荧光组织经4%多聚甲醛固定、梯度酒精脱水、石蜡包埋，切取4 μm 厚切片。按照免疫组织化学或者免疫荧光双染实验说明进行染色，显微镜下观察采图，使用Image-Pro Plus 6.0 分析并统计数据。MVD 统计按照Weidner校正方法，每个标本先在低倍镜（×200）下选取微血管密度高的区域即“热点”，在每个“热点”中计数5 个高倍镜（× 400）视野下的微血管数，取其平均值为MVD 值。CD163 免疫组化统计，在低倍镜（×200）下观察切片，计数5 个高倍镜（×400）视野下的阳性细胞数，取其平均值为CD163 阳性细胞数。

1.2.5 Western blot将保存于-80 ℃的裸鼠组织切取适量，加入配置好的全蛋白裂解液，研磨匀浆，离心后取上清液，配置成50 μg/10 μL 的蛋白上样品。将10 μL 蛋白上样品于10%的SDS-PAGE 电泳，之后湿转60 min 于PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，相应抗体4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL 显影液曝光存图。使用Image J 软件对条带进行分析。

1.3 统计学方法各独立实验均重复3 次，采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，各组数据用（±s）表示，两样本比较采用独立样本t检验法，CD163阳性细胞和MVD 两者之间采用Pearson 相关性分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人胃癌及癌旁组织中M2 型巨噬细胞与MVD的表达情况及相关性免疫组织化学结果显示，CD163 主要表达于M2 型巨噬细胞的胞膜，M2 型巨噬细胞为椭圆形有突起棕黄色细胞（图1A）；CD34主要表达于血管内皮细胞的胞膜和胞质，肿瘤微血管表现为形状不规则且排列紊乱（图1C）。统计结果显示，胃癌组织中M2 型巨噬细胞和MVD 的表达明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P=0.004、0.001，图1C、D）。Pearson 相关性分析表明，胃癌组织中M2 型巨噬细胞浸润数量与MVD 呈正相关（r=0.701 3，P＜0.000 1，图1E）。

图1 免疫组化检测人胃癌及癌旁组织中CD163 和CD34 表达情况（×200、×400）Fig.1 Immunohistochemistry was used to detect the expression of CD163 and CD34 in gastric cancer and para-carcinoma tissues（×200、×400）

2.2 人胃癌及癌旁组织中M2 型巨噬细胞和微血管分布关系免疫荧光双染结果显示（图2），M2型巨噬细胞是带有蓝色细胞核的红色标记细胞，肿瘤内血管是绿色荧光标记的管腔样结构，M2 型巨噬细胞和肿瘤微血管均定位于肿瘤间质，并且M2 型巨噬细胞多浸润在血管周围，胃癌组织中M2 型巨噬细胞和微血管数量明显高于癌旁组织。

2.3 DS 对裸鼠腹腔种植转移瘤的影响裸鼠腹腔注射人胃癌细胞BGC-823 14 d 后，可见裸鼠腹腔多发转移瘤，多转移在大网膜、肠系膜和肝脏，为灰白色硬质结节，提示裸鼠腹腔种植转移肿瘤模型构建成功。肉眼可见DS 组肿瘤体积和数量明显低于对照组（图3），统计结果显示DS组腹腔肿瘤结节数明显低于对照组，差异有统计学意义（P=0.014）。

图2 免疫荧光检测人胃癌及癌旁组织CD163 和CD34（×400）Fig.2 Immunofluorescence assay was used to detect the expression of CD163 and CD34 in gastric cancer and para-carcinoma tissues（×400）

图3 DS 组和对照组裸鼠腹腔种植转移瘤形成情况Fig.3 Abdominal metastasistumor formation of nude mice in DS group and control group

2.4 DS 对裸鼠胃癌腹腔种植转移瘤中M2 型巨噬细胞浸润和MVD 的影响免疫组织化学结果显示，M2 型巨噬细胞定位于转移瘤组织周围，微血管定位于转移瘤组织中，DS 组裸鼠M2 型巨噬细胞浸润程度（图4A）和MVD（图4B）明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.5 DS 对裸鼠胃癌细胞肝脏转移瘤中CD163、VEGF、VEGFR2 表达的影响Western blot 检测肝脏转移瘤CD163、VEGF和VEGFR2蛋白的表达水平（图5）。结果显示，与对照组比较，DS组的VEGFR2、CD163、VEGF 的表达显著降低，差异有统计学意义（P=0.037、0.002、0.001）。

图4 免疫组化检测DS 组和对照组CD163 和CD34 的表达情况（×400）Fig.4 Immunohistochemistry was used to detect the expressionof CD163 and CD34 in DS groupand control group（×400）

图5 Western blot 检测DS 组和对照组CD163、VEGF、VEGFR2 蛋白表达情况Fig.5 Western blot was used to detect the expression of CD163，VEGF and VEGFR2 in DS group and control group

3 讨论

胃癌患者死亡的主要原因是发生转移，转移涉及癌细胞过度增殖、侵袭和转移及血管生成等一系列生物学行为，其中新生血管的生成为肿瘤细胞提供营养及氧气，是转移灶形成的必要条件［5］。抑制肿瘤转移灶中血管生成是抑制转移的有潜力策略［8］。肿瘤微环境是肿瘤血管生成的场所，其中M2 型巨噬细胞作为肿瘤微环境中含量最丰富的免疫细胞，能够刺激肿瘤血管生成，其浸润程度与微血管密度有密切关系［9-10］。本研究的人胃癌组织标本的免疫组化和免疫荧光双染结果表明，胃癌组织中M2 型巨噬细胞浸润数量与MVD显著高于癌旁组织，这与SAMMARCO 等［3］之前的报道一致。并且M2 型巨噬细胞多浸润在血管周围，二者数量上呈正相关。有报道称M2 型巨噬细胞浸润程度高的胃癌患者发生转移的情况更常见［11］。有研究表明不同TNM 分期患者的MVD 差异有统计学意义，MVD 高的患者临床转移发生率较高［12］。因此将M2 型巨噬细胞与血管生成相关因子作为靶点抑制胃癌组织血管生成，进而抑制转移瘤形成。

胃癌发生腹腔和腹膜转移时，患者对化疗的敏感性降低，其中一个原因是血液-腹膜屏障阻止药物进入腹膜层［13］，并且肿瘤内微血管通常管腔狭窄、弯曲畸形、排列紊乱，因而降低了药物疗效［14］。腹腔给药的优点是使抗癌药物能够在腹腔内达到高浓度，并使抗癌药物可以直接接触腹膜内游离癌细胞，从而提高治疗效果，其中影响腹腔给药疗效的几个重要药物特性分别是抗肿瘤活性、分子量大、易溶性及易离子化、腹腔吸收慢和刺激性小［15］。近年来对肿瘤免疫的研究使人们对免疫细胞间与肿瘤细胞的相互作用有了更深的认识，组合带有免疫检查点阻滞剂的抗血管生成药物已成为抗肿瘤研究热点［16］。DS 正是这样一种有潜力的药物，笔者前期对腹腔使用DS 的裸鼠肝肾功能进行检测发现，DS 对肝肾功能无影响，本研究发现DS 可以抑制肿瘤组织中免疫细胞M2 型巨噬细胞的浸润并降低微血管密度。

本研究的动物实验表明，应用DS 的裸鼠腹腔转移瘤的体积和数量明显减少，镜下可见DS 组肿瘤细胞排列比对照组更为疏松，细胞核固缩甚至碎裂，组织出现明显坏死。此外，免疫组化结果显示DS 组转移瘤组织周围M2 型巨噬细胞浸润和血管数量明显减少，说明DS 可以减少肿瘤组织周围M2 型巨噬细胞浸润和血管的新生，从而抑制肿瘤细胞在腹腔种植转移。

肿瘤组织血管生成过程中，VEGF/VEGFR2 信号通路是最重要途径之一［17］。VEGF 与其受体VEGFR2结合后，激活了受体酪氨酸激酶结构域的活性并上调了下游信号系统，通过增强内皮细胞有丝分裂和迁移能力、降解血管内皮外基质等生物活性，促进血管生成［18］。本研究的Western blot 结果显示DS 组裸鼠肿瘤组织中CD163、VEGF、VEGFR2 的蛋白表达显著低于对照组，表明DS可以抑制裸鼠胃癌肝转移组织中M2型巨噬细胞和血管生成相关蛋白的表达，从而抑制血管生成进而抑制腹腔种植转移。

综上所述，DS 可以通过减少M2 型巨噬细胞的浸润数量以及肿瘤组织中VEGF、VEGFR2 蛋白表达，从而抑制肿瘤血管生成，进而一定程度上抑制胃癌细胞腹腔种植转移。M2 型巨噬细胞影响胃癌血管生成是一个复杂的、多因素参与的过程，关于DS 如何减少M2 型巨噬细胞的浸润进而发挥抗胃癌血管生成和腹腔转移的机制还需进一步研究。