新型黏着斑激酶抑制剂CT-707对肝癌细胞的影响及机制研究

姚红兵 郭威 吴嘉兴 蒋建晖 李桂鲜

桂林医学院第二附属医院肝胆胰外科（广西桂林541000）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种恶性程度极高的肿瘤，由于治疗手段的局限，且预后较差，容易复发，因此病死率极高［1-5］。与其他实体瘤相比，HCC 的主要特点包括高侵袭性和高转移能力［6-8］。尽管临床上已经针对HCC 展开了大量的研究，但是HCC 目前预后仍然较差，复发和转移率高，5年生存率仍然很低［9-10］。造成这种现象的主要原因是HCC 发病早期症状不明显，当患者被诊断出HCC 时已经处于无法治愈的晚期［11-13］。索拉菲尼是国内目前唯一经过批准的用于治疗肝癌的靶向治疗药物，在治疗后期肿瘤细胞容易出现药物耐受，临床治疗效果不佳［14-16］。因此，寻找一种副作用少、安全性高的新型抗癌药物用于肝癌治疗迫在眉睫。

CT-707 是一种新型多靶点激酶抑制剂，能够通过拮抗FAK 影响肿瘤微环境和肿瘤进展［17-20］。本研究主要通过生化分子、细胞生物学以及小鼠成瘤模型等手段探讨CT-707 对肝癌细胞系JHH7的影响及可能参与的信号通路，为临床上治疗肝癌提供新的方向和策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物于上海林畅生物有限公司购买12 只雌性SPF 级BALB/c 裸鼠，周龄为6 周，饲养在SPF 等级鼠房，室温恒定，通风良好，水和食物充足。动物实验和细胞实验均经过桂林医学院第二附属医院伦理委员会审核批准。

1.2 HCC 细胞株HCC 细胞株JHH7 培养在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素/链霉素的DMEM中，培养条件为37 ℃、5% CO2恒温培养箱。细胞传代时，去掉培液，PBS 清洗后用胰蛋白酶37 ℃消化2 min。细胞分实验组和对照组。实验组使用1.6 nmol/L 的CT-707（DMSO 溶液）处理细胞，对照组使用同体积DMSO 处理细胞。

1.3 试剂CT-707（Selleck，中国）；血清（Hyclone，中国）；DMEM（Hyclone，中国）；RNA 提取试剂盒（Thermo，USA）；RNA逆转录试剂盒（promega，USA）；AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、β-actin 抗体（sigma，USA）

1.4 实验方法

1.4.1 MTT 试验细胞药物处理48 h 后，用MTT法检测JHH7 细胞的存活情况。将不同组细胞铺在96 孔板（5 × 103细胞/孔），37 ℃培养24 h。MTT 溶液（0.5 mg/mL）被添加到每个孔中，37 ℃培养3 h。随后，加入DMSO 溶解甲瓒晶体。采用ELISA plate reader（Bio-Rad Laboratories，Inc.）检测490 nm 波长的吸光度，检测细胞增殖情况。

1.4.2 克隆形成试验用克隆形成试验检测细胞增殖情况将不同组细胞铺在6 孔板（5 × 104细胞/孔），37 ℃培养72 h。去掉培液后，每孔加2 mL 4% PFA 稀释的结晶紫（终浓度为0.02%），室温孵育1 h 后，去掉染液，用PBS 洗两次，拍照。

1.4.3 Annexin V 试验为了检测细胞凋亡，在细胞处理48 h 后，使用Annexin-V-FLUOS Staining kit（Roche Diagnostics，Basel，Switzerland）进行Annexin-V-FLUOS 检测。具体步骤是，在室温下1 000 r/min离心5 min 后，细胞用500 μL 结合缓冲液重悬。接下来，加入5 μL Annexin V 和10 μL propidium iodide 溶液，在暗室中室温放置15 min。然后使用FACSCalibur 流式细胞仪（BD Biosciences，Franklin Lakes，USA）进行流式细胞仪检测，并使用CXP 软件1.0（Beckman Coulter，Inc.，Brea，CA，USA）对数据进行分析。

1.4.4 Western blot 检测对于蛋白质的提取，细胞被置于radioimmunoprecipitation assay lysis buffer（Beyotime Institute of Biotechnology，Haimen，China）中，14 000 r/min 4 ℃离心15 min。然后用Nano-Drop 2000 仪器（Thermo Fisher Scientific，Inc.）测定蛋白质浓度。等量的蛋白质被12%的SDS-PAGE分离，转移到PVDF 膜上。随后用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，膜用PBST 洗3 次后，抗体4 ℃孵育过夜。随后用PBS T 洗涤3 次，然后用HPRT 标记的二抗室温孵育1 h（1∶10 000；cat. no. sc-516180；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。孵育后，用PBS-T洗涤3 次，用增强化学发光法（Beyotime Institute of Biotechnology）分析抗原-抗体复合物。使用β-actin 作为内参。Western blot 结果由Image J 软件1.48 版本（National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA）进行量化。

1.4.5 裸鼠皮下移植瘤模型从斯莱克公司购买6 周大小的雌性Balb/c 裸鼠，在SPF 等级环境下饲养，分为对照组和CT-707 组。在肝癌细胞系裸鼠移植成瘤模型中，将肝癌细胞系JHH7 重悬至20 million/mL，每次皮下注射100 μL，每只裸鼠注射两侧（做皮下裸鼠成瘤实验一般都是大腿腹股沟两侧均注射），注射部位为大腿腹股沟，每组注射6 只。等到肿瘤长到5 ～6 mm 的时候，腹腔注射CT-707（20 mg/kg），间隔1 d 注射1次，每周测定动物体质量、瘤体大小2 次，连续给药45 d，实验结束时测定瘤质量和主要脏器质量，对瘤体和动物主要脏器进行组织病理学检查，并计算抑瘤率。

1.5 统计学方法所有的数据使用均值±标准差表示，统计分析采用SPSS 19.0 软件（IBM，Armonk，NY，USA）和GraphPad Prism 5.0 软件（GraphPad software，Inc.，La Jolla，CA，USA）进行。采用单因素方差分析的方法分析各组间的差异，然后进行Dunnett′st检验。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CT-707 能够降低细胞的存活能力，抑制细胞的增殖MTT 试验结果表明，与对照组比较，CT-707 处理能够明显降低细胞的存活能力，且这个过程具有时间依赖性，CT-707 处理时间越久，对细胞的存活影响越强，差异有统计学意义（P＜0.05，（图1）；克隆形成试验表明，与对照组相比，CT-707 处理能够显著抑制细胞的增殖，且差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。

图1 CT-707 对细胞存活能力的影响Fig.1 The effect of CT-707 on cell viability

2.2 CT-707 能够抑制细胞周期，促进细胞的凋亡流式结果表明，与对照组相比，CT-707 处理能够明显抑制DNA 的复制，促进细胞周期阻滞，使细胞周期停留在G1 期，且差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，CT-707 处理能够明显促进细胞的凋亡，且差异有统计学意义（P＜0.05，表1）；Western blot 结果表明，与对照组相比，CT-707 处理能够明显抑制细胞周期相关蛋白PCNA、Cyclin D1 的表达，促进凋亡相关蛋白CI-caspase-7、CI-caspase-9 的表达（表2）。以上结果表明CT-707 能够抑制细胞周期，促进细胞的凋亡。

图2 CT-707 对细胞增殖能力的影响Fig.2 The effect of CT-707 on cell proliferation

表1 CT-707 对细胞周期和凋亡的影响Tab.1 The effects of CT-707 oncell cycle and apoptosis±s

表1 CT-707 对细胞周期和凋亡的影响Tab.1 The effects of CT-707 oncell cycle and apoptosis±s

注：与对照组比较，*P ＜0.05

组别对照组CT-707 组细胞周期G1 期52.26±0.45 62.85±2.42*S 期22.38±1.52 18.62±1.15*G2/M 期16.41±0.85 15.89±0.71细胞凋亡（%）9.21±1.68 13.31±1.22*

表2 CT-707 对细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的影响Tab.2 The effects of CT-707 oncell cycle related proteins and cell apoptosis related proteins±s

表2 CT-707 对细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的影响Tab.2 The effects of CT-707 oncell cycle related proteins and cell apoptosis related proteins±s

注：与对照组比较，*P ＜0.05

组别对照组CT-707 组细胞周期相关蛋白PCNA 1.00±0.02 0.62±0.05*Cyclin D1 1.00±0.03 0.80±0.04*细胞凋亡相关蛋白CI-caspase-7 1.00±0.01 3.24±0.12*caspase-7 1.00±0.02 1.86±0.62*CI-caspase-9 1.00±0.02 12.35±1.12*caspase-9 1.00±0.01 1.63±0.56*

2.3 CT-707 能够抑制肿瘤的形成裸鼠皮下移植模型表明，CT-707 腹腔注射能够显著抑制肿瘤的形成，肿瘤的大小和质量显著降低，且差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。以上结果表明CT-707 能够抑制肿瘤的形成。

3 讨论

HCC 是我国发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，由于肝癌早期症状不明显，因此超过一半的患者在确诊时为晚期［21］。由于目前临床上针对肝癌的治疗手段有限，唯一批准上市的肝癌靶向药物索拉菲尼副作用较大，且肿瘤细胞容易出现药物耐受而复发。因此对于深入研究肝癌发病机制、开发新型安全有效的分子靶向药物，对于肝癌的治疗尤为重要。

CT-707 是一种多靶点激酶抑制剂，能够通过拮抗多种酪氨酸激酶如FAK、ALK 等，影响肿瘤微环境和肿瘤的发生，目前该药物正在进入临床Ⅰ期试验［22-25］。MTT 试验和克隆形成试验常用来进行大规模抗癌药物筛选，是体外检测细胞存活和增殖能力常用的手段［26-27］。本研究发现，CT-707处理能够降低细胞的存活能力，过程具有时间依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）；克隆形成试验表明，与对照组相比，CT-707 处理能够抑制细胞的增殖，差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果表明CT-707 能够降低细胞的存活能力，抑制细胞的增殖。裸鼠皮下成瘤模型则是模拟药物在体内对肿瘤的影响［30］。本研究发现CT-707 腹腔注射能够显著抑制肿瘤的形成，肿瘤的大小和质量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 CT-707 对肿瘤形成的影响Fig.3 The effect of CT-707 on tumor formation

流式检测细胞周期和细胞凋亡是用于检测药物对肿瘤细胞影响常用的生物学手段［28-29］。本研究发现，CT-707 处理能够明显抑制DNA 的复制，促进细胞周期阻滞；CT-707 处理还能够明显促进细胞的凋亡，差异有统计学意义（P＜0.05）；以上结果表明CT-707 能够抑制细胞周期，促进细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的形成。

在大部分的肿瘤细胞中，PI3K/AKT 通路会处于异常活化状态，AKT 和mTOR 会处于高度磷酸化状态，并且此通路与细胞的增殖和凋亡有关，抑制该通路的活化会抑制肿瘤细胞的异常增殖和恶性转化，因此PI3K/AKT 通路是临床治疗肿瘤的重要靶点［31-32］。为了探讨CT-707 影响细胞存活和肿瘤形成的具体分子机理，本课题下一步研究拟通过Western-blot 检测了PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关蛋白的表达水平，探讨CT-707 是否能够抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路的激活来抑制肝癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡，抑制肿瘤的形成。

本研究首次证实了新型多靶点激酶抑制剂CT-707 对肝癌细胞生物学行为的影响，并分析了其相关机制，为临床上肝癌治疗靶点的选择提供理论依据。但本研究仍旧存在一定不足和局限性。本研究只使用肝癌细胞系和裸鼠皮下成瘤模型，未来可能需要使用PDX 模型做进一步的功能研究，以及药物对机体的副作用，从而为临床用药提供理论基础。目前细胞学研究主要集中在CT-707 对肝癌细胞增殖和凋亡以及细胞周期的影响，但对肝癌细胞侵袭、转移等生物学行为有待进一步分析。本研究中CT-707 对肝癌细胞作用的信号通道方面机制，也有待进一步深入探讨，包括分析PI3K/AKT/mTOR 信号通路下游相关因子的影响以及其他相关通路的作用机制，以及在进一步的体内试验研究中还需探讨对肝癌动物模型生存期以及肿瘤进展、复发等的影响，以便为临床试验提供更多依据。