武汉蔬菜市场大白菜软腐病新病原菌鉴定

孙齐英 夏明

摘要：在大白菜贮藏和运输期间极易受真菌、细菌等微生物侵染而导致软腐病，鉴定软腐病的病原菌是防治大白菜软腐病的重要前提。对武汉市洪山区白沙洲蔬菜市场大白菜软腐病进行病原鉴定。从大白菜软腐病病部分离并培养病原物，并进行形态观察、生理生化鉴定、回接试验、致病性试验及基因测序。结果表明，大白菜软腐病的病原菌菌株S3菌落为灰白色，圆形，中部稍隆起，边缘呈半透明状;菌体为杆菌，革兰氏阴性菌;不产酸，不能分解色氨酸、产生吲哚，甲基红（M.R.）试验为阴性，乙酰甲基甲醇（V.P.）试验为阴性，不产H2S，容易从伤口侵入。与假单胞菌属（Pseudomonas sp.）细菌的16S rDNA序列的一致性为99.40%，说明该病原为假单胞菌属。

关键词：大白菜;16S rDNA;软腐病;病原菌;假单胞菌属;鉴定

中图分类号： S436.341.13  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）15-0141-03

受副热带高压控制，湖北武汉夏季呈现出气温高、湿度大、时间长等特点，加上大白菜在运输途中由于挤压、碰撞形成伤口，极易在短时间内发生大面积软腐病，损失极大，严重影响大白菜市场供应[1]。一般认为，大白菜软腐病病原菌是胡萝卜软腐欧式杆菌（Erwinia carotovora var.carotovora）[2-4]。本研究从武汉市蔬菜批发市场成功分离出大白菜软腐病的病原菌，采用形态观察、生理生化試验以及分子鉴定，确定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），与前人报道的大白菜软腐病病原菌为胡萝卜软腐欧式杆菌不同，这为大白菜软腐病防治提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受检作物 当季的黄心大白菜（来自武汉市洪山区白沙洲农副产品大市场，产地多为湖北省周边城市及海南省），分别挑选健康和已经腐烂的叶球若干。

1.1.2 主要试剂 试验主要试剂有LB（Luria-Bertani）固体培养基（1 L）、LB液体培养基（1 L）、葡萄糖蛋白胨水培养基（1 L）、硫酸亚铁琼脂培养基（SIM培养基）、蛋白胨水培养基（1 L）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×Buffer、5×TBE、溴化乙锭（EB）染剂、草酸铵结晶紫染液、番红染液。

1.1.3 主要仪器 试验主要仪器有高压灭菌锅、光学显微镜、超净工作台、摇床、生化培养箱、气候培养箱、聚合酶链式反应（PCR）仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析系统。

1.2 试验方法

1.2.1 大白菜软腐病的症状肉眼观察试验 肉眼观察大白菜软腐病的病状和病症，观察发病部位。

1.2.2 病原菌的分离与纯培养 取腐烂的大白菜组织冲洗10 min，沥干水分，将大白菜组织切成小块，乙醇浸泡30 s，冲洗2～3次，加入0.1%次氯酸溶液浸泡10 min，冲洗2～3次，加入50 mL无菌水，用滴管抽打制成含有菌体的悬浊液。取1 mL细菌溶液用无菌水稀释并涂布在LB固体培养基上，28 ℃ 避光培养2～3 d。再挑选优势菌落在LB固体培养基上划线培养，28 ℃避光培养24～48 h，重复划线操作直至得到单菌落，观察其菌落形态。

1.2.3 病原菌的回接试验 将获得的3株单菌落（S1、S2、S3）接种到LB液体培养基并置于28 ℃、140 r/min 的摇床中避光培养16～24 h，离心收集细菌，用无菌水配制成3×108 CFU/mL悬浮液。

取健康的大白菜叶片，将叶柄部分切成4 cm×4 cm方形小块，放入烧杯中，加75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗2～3次，用0.1%次氯酸溶液浸泡 10 min，无菌水冲洗2～3次。无菌纸吸干水分，参照Hu等的方法[5]接种3种单菌落菌液，再将其分别置于空培养皿（垫有滤纸）中，无菌水接种作为对照。培养皿用封口膜密封，置于28 ℃、80%湿度气候培养箱中培养，每天观察发病情况。

1.2.4 病原菌的致病性鉴定 选取有致病作用的S3，按“1.2.3”的方法制成3×108 CFU/mL细菌悬浮液。用注射器取0.5 mL液体喷洒健康的大白菜叶柄表面（形成悬浮滴为宜）进行离体接种试验。

试验分5个处理：不划伤口，取0.5 mL LB液体培养基直接喷洒叶柄表面，光照条件下培养（处理1）;叶柄划长约1 cm、深3 mm伤口，LB液体培养基喷洒叶柄伤口表面，光照条件下培养（处理2）;不划伤口，取0.5 mL S3液体培养基直接喷洒叶柄表面，光照条件下培养（处理3）;划伤口，S3液体培养基喷洒叶柄伤口表面，光照条件下培养（处理4）;划伤口，S3液体培养基喷洒叶柄伤口表面，黑暗条件下培养（处理5）。28 ℃保湿培养，每天观察发病情况。

1.2.5 病原菌的形态观察及生理生化鉴定

1.2.5.1 革兰氏染色反应和形态观察 参照文献[6]进行病原菌的革兰氏染色和形态观察。将获得的S3单菌落在LB液体培养基中进行扩大化培养，置于28 ℃、140 r/min的摇床中避光培养16～24 h。用滴管吸取菌液，经草酸铵结晶紫染液初染，乙醇脱色，番红染液复染后于100倍油镜下观察形态。

1.2.5.2 生理生化鉴定 对S3菌株进行生理生化鉴定，鉴定项目包括H2S试验、V.P.试验（伏-普试验）、M.R.试验（甲基红试验）、吲哚试验，具体方法参照《微生物学实验》[7]。

1.2.6 16S rDNA鉴定 将纯化后的菌株接种在LB液体培养基中，于28 ℃下培养16～24 h，离心，收集菌体，提取细菌基因组，得到DNA模板，通过16S rDNA通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492 R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增，随后在1%琼脂糖凝胶上进行电泳并观察结果，将条带单一的PCR样品送至武汉天一辉远生物科技公司进行测序，随后将测序结果在NCBI上进行序列比对以确定致病菌。PCR体系：由dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×buffer、Mg2+混合成的2×Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，剩余用ddH2O补齐至25 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，重复循环25次;72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 大白菜软腐病的症状肉眼观察结果

肉眼观察到大白菜软腐病的症状为受到侵染的植物组织最初成半透明水渍状，随着病斑的不断扩大造成叶球中心靠近茎基部大面积软腐，并且散发恶臭。病斑为黄褐色，表皮完整，撕破表皮有黄褐色黏液流出（图1）。

2.2 病原菌的分离与菌落观察结果

从病组织中分离纯化培养出3种类型的菌落：S1菌落，形态为浅黄色，圆形，光下成半透明状;S2菌落，形态为白色圆形，光下成半透明状;S3菌落，形态为灰白色圆形，比S2略大，光下中心部分稍隆起不透明，周围半透明（图2）。

2.3 病原菌的回接试验结果

回接试验结果显示，从病组织分理出的S3接种健康的大白菜小块培养1 d后，接种处出现明显的水渍状病斑，并逐步向外扩散;2 d后症状加重，病斑变为深褐色，表皮与内部组织分离;7 d后，整个大白菜小块皱缩成黑色小块。S1、S2、对照在培养 7 d 后除接种处出现黑黄色愈合伤疤，其他正常。说明S3引起大白菜健康组织明显软腐病变，与肉眼观察的大白菜软腐病的典型症状相同，可以初步断定S3为病原菌。

2.4 病原菌的致病性鉴定结果

由图3可以看出，处理4发病状况最为严重，2 d 病组织出现明显黄褐色，叶肉和表皮组织分离现象，变得不透明，4 d全部腐烂坏死，7 d植物组织崩溃。处理3直到4 d才出现黄褐色，发生病变的程度比处理4明显要轻，处理1、2整个试验期没有病变。说明大白菜软腐病病菌的容易从伤口侵入。

图3中e为处理4、5接种5 d后发病情况的症状对比，可以看出，处理5在第5天组织完全倒塌，缩成黑色小块，发病程度明显比处理4严重。说明病原菌在光照条件下致病力比黑暗条件下更强。

2.5 S3菌株的生理生化鉴定与形态观察结果

从S3菌株生理生化试验结果表明，甲基红试验（M.R.）为阴性，乙酰甲基甲醇试验（V.P.）为阴性，吲哚试验为阴性，不产H2S。S3为革兰氏阴性菌，油镜下观察发现，该菌为短杆状，长度为0.625～1.25 μm，有微弱额运动性（图4），符合植物病原细菌假单胞菌属（Pseudomonas）形态和生理生化特征[2]。

2.6 病原菌的PCR鉴定

通过对S3菌株的16S rDNA进行 PCR扩增得到单一条带并进行测序，该序列在NCBI上进行比对分析以初步鉴定目标菌株。测序结果表明，S3菌株与假单胞菌属（Pseudomonas sp.）细菌的16S rDNA序列的一致性为99.40%，推断S3菌株为假单胞菌属细菌。

3 讨论与结论

本研究通过对武汉蔬菜市场的大白菜软腐病的致病菌进行分离并对其进行形态学观察、生理生化鉴定及致病性试验，结果显示，该病原物与假单胞杆菌的特征一致，16S rDNA的测序结果进一步显示该菌与假单胞菌属（Pseudomonas sp.）细菌的16S rDNA序列的一致性为99.40%，因此可以认定引起大白菜软腐病的S3菌株为假单胞属细菌。一般认为，假单胞属细菌主要导致植物叶枯型、叶斑型或青枯型病害，而软腐型病害主要由胡萝卜软腐欧式杆菌引起[2]，但也有试验发现，假单胞杆菌属可以导致植物软腐病，如格氏假单孢菌（P. grimontii）引起蝴蝶兰软腐病[2]， 恶臭假单孢菌（P. putida）引起番茄软腐病[8]，荧光假单孢菌（P. fluorescens）引起黄瓜茎软腐病，边缘假单孢菌（P. marginalis）可以引起马铃薯茎块[9]、马蹄莲[10]、百合[11]等软腐病，边缘假单孢菌和白枯病假单孢菌引起葱属植物叶片软腐病[12]，假单孢菌属细菌引起魔芋软腐病[13]。本研究也说明胡萝卜软腐欧式杆菌不是引起软腐病的唯一原因。

一般认为，从自然孔口侵入的植物病原细菌更容易从伤口侵入[2]， 本试验也证实假单胞杆菌可以从自然孔口侵入，但更容易从伤口侵入，2 d即可发病，其发病迅速，建议在大白菜运输和贮藏的过程中要尽量避免因挤压、碰撞等造成伤口。

软腐病是由于细菌分解果胶酶裂解植物细胞中胶层引起，胡萝卜软腐欧式杆菌可以产生果胶酶导致软腐[14]，假单胞杆菌一般产生植物毒素导致坏死[2]，其引起软腐的致病机制有待进一步探讨。

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