新疆大叶苜蓿生物量及抗氧化酶类对土壤水分胁迫的响应

陈雅婷，罗永忠，申海宁，惠雅佞

(甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070)

人类对自然资源的过度开发利用，导致全球气候格局改变，极端干旱发生的频率和强度逐年增加[1].随着水资源危机和干旱化危害的不断加剧，植物如何适应干旱已经成为全球研究的重要课题之一.据了解，干旱造成的植物损伤和粮食减产超过其他一切环境因素所导致的危害的总和[2].通过研究植物对土壤水分胁迫的生理响应和生态适应性,有利于分析植物抗旱能力和对干旱环境的适应性变化[3].

紫花苜蓿(Medicagosativa)是目前全球分布最广、栽培面积最大的牧草品种之一.因其营养价值高和产量好等优点被称为“牧草之王”[4-5].同时,苜蓿还是优良的水土保持植物,它茎叶繁茂,根系发达,在拦截径流、防止冲刷、减少水土流失方面发挥着十分重要的作用.新疆大叶苜蓿(Medicagosativa.L.cv.Xinjiang Daye)属于产量和品质方面优质的紫花苜蓿品种之一.虽然具有一定的抗旱性,但严重干旱也会影响新疆大叶苜蓿的生长和产量.近年来，土壤水分胁迫对苜蓿生长和生理影响的研究已有大量报道.罗永忠等[6]指出在轻度水分胁迫下,新疆大叶苜蓿的叶片、茎、主根鲜生物量和干生物量均最大,最适宜新疆大叶苜蓿生长;土壤水分含量过高或过低均不利于新疆大叶苜蓿生物量的积累；柳佳等[7]比较了在田间持水量为85%、65%和45%的土壤水分胁迫下新疆大叶苜蓿生物量的变化状况，指出了在重度水分胁迫下根冠比最大；刘国利等[8]研究表明，水分胁迫可提高新疆大叶苜蓿水分利用效率，增加新疆大叶苜蓿叶片细胞膜透性，并且在水分胁迫下各种酶协同作用来抵御干旱胁迫的伤害，从而起到一定的保护作用.但关于干旱胁迫程度对新疆大叶苜蓿生长和抗氧化酶活性以及丙二醛含量之间的耦合关系的研究报道甚少.因此,本研究探讨新疆大叶苜蓿在土壤水分胁迫下生长和生物量分配、抗氧化酶活性及丙二醛含量之间的相互作用关系.以期进一步了解新疆大叶苜蓿的抗旱机制并为其在干旱区节水灌溉农业中的推广和种植以及为建立持久稳定高产的畜牧业生产体系提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 试验区概况

本试验选择在甘肃农业大学林学院径流场内进行，该地区属于温带大陆性气候区，年平均降水量327 mm,年均气温10.3 ℃，年日照时数为2 446 h，无霜期为180 d.

1.2 试验材料

本试验以甘肃农业大学草业学院提供的新疆大叶苜蓿(Medicagosativa.L.cv.Xinjiang Daye)种子为材料，采用盆栽方法，用高30 cm、直径26 cm的圆柱形聚乙烯塑料桶，取耕作层表土，每桶装风干土8.0 kg，用水沉实待用.土层为沙壤土，试验前测得田间含水量为22.5%(质量含水量).2018年4月1日播种，每桶播50粒，苗齐后留壮苗20株.播种前按1∶4的比例添加氮肥(1 g尿素+4 g(NH4)2HPO4)混匀；统一防治病虫害.次年4月6日返青(70%的植株出苗)，4月26日分枝(70%的植株分枝)，5月15日现蕾(60%的枝条上有花蕾)，6月7日开花(60%的植株开花).

1.3 试验方法

试验设置3个不同的水分梯度，即处理A(TA：full water supply)为充分供水(土壤水分含量保持田间持水的85%，实际含水量17.08%～19.25%)、处理B(TB:mild water stress)为轻度水分胁迫(土壤水分含量保持田间持水的65%，实际含水量12.16%～15.06%)、处理C(TC:severe water stress)为重度水分胁迫(土壤水分含量保持田间持水的45%，实际含水量7.67%～9.21%).每个处理3个重复，称质量法控制土壤含水量，使用电子感应秤于每天下午18∶00称质量补水，塑料防雨棚拦截全部自然降水.

选用不同水分胁迫下生长状况中庸的植株叶片于返青期(4月6日)、分枝期(4月26日)、现蕾期(5月15日)和开花期(6月7日)4个生育期对新疆大叶苜蓿测定相关指标.

1.3.1 生物量测定 每个重复各选3桶，每桶各取3个植株，将其根系全部挖出，保证根系的完整性，带回实验室后用水冲洗干净根系部分残留的土垢，然后将每株的根、茎、叶一一分离后测定各处理新疆大叶苜蓿地下根鲜质量、地上部分茎叶鲜质量，放置于70 ℃烘箱烘至48 h，称质量获得根干质量(root dry mass,RDM)、茎干质量(steam dry mass,SDM)、叶干质量(leaf dry mass,LDM)及总干物质量(total dry mass,TDM)，这些指标能反映苜蓿的生长状况，计算出根冠比(ratio of root dry mass to overground shoot dry mass,RR/S)从而得出生物量分配的情况，RR/S=RDM/(LDM+SDM)[9].

1.3.2 过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的酶活性以及丙二醛含量的测定 在不同水分梯度下的桶中摘取植物上部第3～5片成熟展开且无病虫害的叶片为测定对象.用愈创木酚法[10]测定POD的活性，用氮蓝四唑法[11]测定SOD的活性，用紫外吸收法测定[12]CAT的活性，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛[13]的含量.

1.4 数据处理

采用Excel 2013记录并计算试验数据，用SPSS 19.0程序在计算机上对数据进行单因素方差分析，用Excel 2013绘制图表.

2 结果与分析

2.1 不同土壤水分条件对新疆大叶苜蓿生物量积累与分配的影响

整个生育期内不同水分胁迫下新疆大叶苜蓿的生物量积累与分配存在一定的规律(表1).各个时期TB处理下根、茎和叶的干质量均大于TA和TC处理.其中根干质量在返青期和现蕾期差异显著(P<0.05)，在分枝期和开花期各处理之间均无明显差异；茎干质量在开花期无明显差异，其他各生长期差异显著(P<0.05)；而叶干质量在各个生长期都存在显著性差异.

土壤水分胁迫下不同生育期内新疆大叶苜蓿总干物质量呈现出相同的变化规律(图1).各处理依次为：TB>TA>TC.相较于返青期，开花期各水分处理下的总干物质量分别增加了37.11%、37.14%和34.3%，TB处理下的总干物质量增长幅度最大.在分枝期、现蕾期和开花期，TB处理下总干物质量与其他两个处理存在显著性差异(P<0.05).TB处理相较于TA能够更好地促进生物量的积累；随着干旱胁迫的加剧，总干物质量会逐渐减少.

表1 水分胁迫下新疆大叶苜蓿根茎叶的分配情况

在整个生育期内，新疆大叶苜蓿植株的根冠比均呈现出相同的变化规律(图2)，即TC>TB>TA.相较于返青期，开花期各水分处理下的根冠比分别增加了44.49%、60.73%和97.75%，TC处理下的根冠比增长幅度最大.在分枝期、现蕾期和开花期TC处理下根冠比与其他两个处理存在显著性差异(P<0.05).随着水分胁迫的加剧，根冠比增大，说明在水分极其匮乏时，植物会通过促进根系生长，增大根冠比来适应极端干旱条件.

图中不同字母表示同一生育期不同处理间的差异水平(P<0.05).Different letters in the figure indicate the difference level between different treatments in the same growth period (P<0.05).图1 水分胁迫下新疆大叶苜蓿总干物质量的变化Figure 1 Changes of total dry matter quality of Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye under water stress

图中不同字母表示同一生育期不同处理间的差异水平(P<0.05).Different letters in the figure indicate the difference level between different treatments in the same growth period (P<0.05).图2 水分胁迫下新疆大叶苜蓿根冠比的变化Figure 2 Change of root-cap ratio of Medicago sativa.L.cv.Xinjiang Daye under water stress

2.2 不同生长期和水分胁迫对新疆大叶苜蓿抗氧化酶活性的影响

2.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性 由图3可知，SOD活性在不同的水分胁迫下均呈现出先升高后降低的变化趋势，表现出TB处理下的SOD活性在每个生长时期均高于TA和TC处理.在分枝期TA、TB和TC处理下的SOD活性均高于其他3个生长期且达到峰值，其中活性值分别为185.49、226.39、200.48 μg/g.开花期各处理下的SOD活性较分枝期分别下降了15.12%、15.35%和32.85%.返青期和分枝期TA与TB处理之间差异显著(P<0.05)；现蕾期和开花期TB与TC处理之间差异显著(P<0.05).

图中不同字母表示同一生育期不同处理间的差异水平(P<0.05).Different letters in the figure indicate the difference level between different treatments in the same growth period (P<0.05).图3 土壤水分胁迫对新疆大叶苜蓿超氧化物歧化酶(SOD)的影响Figure 3 Effect of soil water stress on the superoxide dismutase of Medicago sativa L. cv .Xinjiang Daye

2.2.2 过氧化物酶(POD)活性 由图4可知，POD活性在不同的水分胁迫下均呈现出先升高后降低的变化趋势，表现出TB处理下的POD活性在各个生育期均大于TA和TC处理.在分枝期TA、TB和TC处理下的POD活性均高于其他3个生长期且达到峰值，开花期各处理下的POD活性较分枝期分别下降了15.12%、15.35%和32.85%，除分枝期和开花期TB与TC处理之间差异显著外(P<0.05)，返青期和现蕾期TA、TB和TC处理之间均无显著性差异(P>0.05).

图中不同字母表示同一生育期不同处理间的差异水平(P<0.05).Different letters in the figure indicate the difference level between different treatments in the same growth period (P<0.05).图4 土壤水分胁迫对新疆大叶苜蓿超氧化物歧化酶(POD)的影响Figure 4 Effect of soil water stress on the peroxidase of Medicago sativa L. cv.Xinjiang Daye

2.2.3 过氧化氢酶(CAT)活性 CAT活性在不同的生长时期和水分胁迫下均呈现持续升高的变化趋势(图5).表现为TB处理下的CAT活性在返青期、分枝期和开花期均大于TA和TC处理.在开花期TA、TB和TC处理下的CAT活性均高于其他3个生长期且达到峰值，其中活性值分别为35.43、38.11、26.49 μg/g.开花期各处理下的CAT活性较返青期上升了46.49%、22.51%和21.52%.在整个生育期TB与TC处理之间的CAT活性差异均达到显著性水平(P<0.05).说明新疆大叶苜蓿CAT活性会随着水分胁迫的加剧而显著增加.

图中不同字母表示同一生育期不同处理间的差异水平(P<0.05).Different letters in the figure indicate the difference level between different treatments in the same growth period (P<0.05).图5 土壤水分胁迫对新疆大叶苜蓿过氧化氢酶(CAT)的影响Figure 5 Effect of soil water stress on the catalase of Medicago sativa L. cv.Xinjiang Daye

2.3 不同水分胁迫对新疆大叶苜蓿MDA含量的影响

由图6可知，新疆大叶苜蓿叶片MDA含量整体变化趋势是随水分胁迫程度的加深和时间的延长而增大.在开花期TA、TB和TC处理下的MDA含量均高于其他3个生长期且达到峰值，开花期3种水分处理下的MDA含量是返青期的2.166、1.917和1.729倍.分枝期和现蕾期TA和TB处理均与TC处理形成显著性差异(P<0.05)，返青期和开花期TA、TB处理和TC处理之间MDA含量均无显著差异(P>0.05).

图中不同字母表示同一生育期不同处理间的差异水平(P<0.05).Different letters in the figure indicate the difference level between different treatments in the same growth period (P<0.05).图6 土壤水分胁迫对新疆大叶苜蓿丙二醛含量的影响Figure 6 Effect of soil water stress on malondialdehyde content of Medicago sativa L. cv.Xinjiang Daye

2.4 不同生育期生物量与抗氧化酶活性及丙二醛含量之间的关系

对水分胁迫下新疆大叶苜蓿4个生育期的生物量与抗氧化酶活性和丙二醛含量之间的相关性进行了研究.结果显示(表2)，不同生育期生物量与MDA含量均呈负相关，说明在不同时期MDA含量的增加影响着生物量的积累速率.生物量与3种抗氧化酶活性在不同生育期呈现一定的正负相关性.其中返青期和分枝期生物量与SOD分别呈负相关和显著负相关(P<0.05)，而与POD和CAT呈正相关或极显著正相关(P<0.01)，说明前期生物量的积累有CAT和POD活性的增加作为前提保证，POD活性则在抗氧化酶中未起决定性作用；在生长后期生物量与3种抗氧化酶呈正相关，其中在现蕾期SOD和生物量之间呈极显著正相关(P<0.01)，说明在生长中后期生物量的积累受3种抗氧化酶的协力保护，保证了随着胁迫时间的延长生物量积累显著.说明各个时期的生物量积累与抗氧化酶活性和丙二醛含量都存在一定的联系.

表2 不同生育期新疆大叶苜蓿生长与抗氧化酶活性及丙二醛含量的相关性分析

3 讨论

3.1 水分胁迫对新疆大叶苜蓿生物量积累的影响

水分胁迫是限制植物生长和生产量的重要逆境因子，还影响植物光合产物的生产、运输、积累和分配[14].生物量的变化是反映新疆大叶苜蓿适应干旱胁迫的外在表现.当土壤含水量降低时，光合产物更多地向根系分配以保证植物的正常生长并且对植物在逆境环境下正常生长起到促进作用.本研究表明，随水分胁迫程度的加剧，新疆大叶苜蓿的生物量显著下降，表现为TB>TA>TC.这与张烈君[15]、葛体达等[16]对水稻、玉米等作物的研究结果相似.表明不同的水分处理对植株的生物量积累和分配造成一定的影响，在TB处理下，不仅能满足植株对水分的正常需求，还能有效且合理地分配根茎叶的占比，促使新疆大叶苜蓿在西北水资源匮乏地区获得最大的收获量.根冠比是植物地下部分和地上部分分配的直接体现[17].水分胁迫使新疆大叶苜蓿的根冠比增加,且根冠比随胁迫强度的增强和胁迫时间的延长而增大,表现为TC>TB>TA.这与李明达等[18]对豌豆的研究结果一致.由此可见，在极端干旱的条件下，植株通过吸收仅有的水分来促进地下部分根的生长以此来吸收更多的营养成分，保证植株的正常生长，从而适应干旱环境.在整个生育期内，随着水分程度的加剧，TB处理下根茎叶的生长均大于TA和TC处理，促进了植株整体的正常发育，说明TB处理下植株生长健壮且长势最好，是植物生长的最佳水分环境.TA处理下，由于水分供应过剩，造成土质粘稠且通透性差，使得根系的生长发育受到一定的影响，根的生长低于TB和TC处理.植株把过多的营养成分供应给地上茎叶，所以TA处理下的新疆大叶苜蓿植株徒长，叶片大而软，生长态势较差.TC处理下,土壤极度缺水，植株会把较多的生物量分配给地下部分来促使根系的生长发育，从而吸收仅有的水分来维持植株的生长.相应的，植株也会牺牲地上部分茎叶来减少多余水分的散失，所以这一处理下地上部分的生长低于TA和TB处理.

3.2 水分胁迫对新疆大叶苜蓿抗氧化酶的影响

植物体内为保护自身免受氧化伤害形成一套相应的抗氧化保护酶系统来保护植物的细胞膜和敏感分子免受活性氧的伤害.植物体内抗氧化酶活性的增加和减少是响应干旱胁迫环境的内在机制[19].随着干旱程度的加深，植物细胞内会产生大量的活性氧，造成细胞膜过氧化，膜的功能和结构遭到破坏，细胞内各细胞器和酶系统无法正常工作，情况严重时还会使植物细胞死亡，最终导致植物的死亡[20-23].本研究表明，SOD和POD的酶活性随着胁迫程度的加深和时间的延长呈现出先上升后下降的趋势，表现出TB处理大于TA和TC处理.在分枝期TA、TB和TC处理下SOD和POD活性增幅最大，并且在分枝期提高保护酶活性来减轻对植株的损坏，以此促进新疆大叶苜蓿的花芽分化，保证植株的正常生长发育.在开花期SOD和POD活性逐渐降低，主要原因是随着水分胁迫时间的延长会打破植株体内活性氧的动态平衡，使得活性氧在植株体内大量积累.但此时SOD和POD活性的减少则是伴随着CAT活性增加而发生的，CAT活性在整个生育期呈现出持续上升的趋势，3个水分处理间依然表现出TB处理大于TA和TC处理，其中TA和TB处理之间CAT活性变化幅度大，正好弥补了SOD和POD活性在生长后期的减少，保证了TA和TB处理下的新疆大叶苜蓿在3种抗氧化酶协同作用下的正常生长；而TC处理下CAT活性则是缓慢上升，变化幅度较为稳定，CAT活性随着水分胁迫时间的延长而增加，主要还是受土壤水分局限性的影响所致，使得CAT活性不足以弥补SOD和POD活性在生长后期的下降，在重度干旱下的新疆大叶苜蓿3种抗氧化酶活性流失严重，在生长后期可能依靠CAT酶的缓慢增长维持植株的生长需要.这一结果与张艳馥等[24]对大豆品种‘垦农18号’CAT活性的研究结果相似，同样表现为干旱胁迫下的‘垦农18号’CAT活性随着时间胁迫的延长而稳定增长.同样也与韩建秋[25]对白三叶的研究结果相似.表现为在重度胁迫下，植物酶活性在胁迫初期有一定程度的提高，但提高的幅度有限，不足以维持活性氧产生与清除自由基之间达到一定的平衡，使植株氧化，最终导致酶活性下降.有研究表明，抗逆性强的品种有较高的过氧化氢酶活性，与抗逆性呈显著相关性.在4个生育期内抗氧化酶活性均表现出轻度水分胁迫下抗氧化酶活性最强，说明在充分供水的情况下，由于水量补充过大，植株很有可能受到水淹，对土壤环境也会产生一定的影响，土质粘稠且根系会受到破坏，也可视为一种胁迫.而这种状态下的新疆大叶苜蓿体内抗氧化酶自然也会受到影响，表现出TA处理酶活性在一般情况下要低于TB处理.重度水分胁迫则是土壤严重缺水，对抗氧化酶活性的增加或降低在不同生长阶段有不同的限制作用.所以就3种水分胁迫下抗氧化酶之间活性的比较，轻度水分胁迫下抗氧化酶活性最高.总体来说，SOD和POD活性在干旱胁迫加剧的中后期，酶活性均会慢慢降低，CAT酶活性则逐渐升高.主要原因是整个保护酶系统防御能力的强弱主要取决于这几种酶彼此协调的综合结果，受水分胁迫后,新疆大叶苜蓿为了减轻干旱对细胞的伤害，保持较高的抗氧化酶活性保证其较强的自由基消除能力,增强了抗旱能力[26].本研究结果与罗永忠[27]对新疆大叶苜蓿研究的结果不一致，其研究表明POD在重度水分胁迫下活性对比其他3个水分胁迫最高，且整个生育期POD活性整体趋势为持续上升，但是在生育后期重度水分胁迫下POD活性出现下降.而本研究POD、SOD和CAT活性均在轻度水分胁迫下积累最多，这很有可能是轻度水分胁迫下植物提前积累抗氧化酶活性，保证植株在轻度干旱胁迫下有足够能力抵御外界胁迫环境，保证植株长势完好，当然也可能是设置水分梯度不同所致.

3.3 干旱胁迫对新疆大叶苜蓿MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化的产物之一，在细胞内含量直接反映了脂质过氧化强度和膜系统受伤害的程度，是逆境生理中的一个重要指标[28-29].植株体内丙二醛含量的多少可以直接反应膜脂过氧化对逆境环境的响应程度[30].在整个生育期内，新疆大叶苜蓿MDA含量在3种水分处理间均表现为：TC>TB>TA，在分枝期和现蕾期TA和TB处理均与TC处理形成显著性差异，说明随着水分胁迫程度的加深，MDA含量显著增加.随着胁迫时间的延长MDA含量整体呈现出上升趋势，且上升幅度大，开花期MDA含量与分枝期相比则是成倍增加.其中TA处理在整个生育期MDA变化幅度均要大于TB和TC处理，这可能是TA处理在长时间充分供水下处于水淹状态从而造成土壤黏重的现象，植物膜脂过氧化作用随之增强,MDA含量发生相应增加,从而加速了植株自然老化的进程，这种增加幅度相比重度水分胁迫更加严重.这一结果与郝玉兰等[31]对玉米在水淹处理以及不同生育期MDA含量显著增加的研究成果相似.以上结果说明，干旱胁迫的加剧和长时间充分供水会使得膜脂过氧化产物增加，同时加剧了对植株体内的毒害[32]，即MDA含量越多，膜脂过氧化程度越高，严重膜透性越大，抗旱能力越弱.

4 结论

本试验研究了不同水分处理对新疆大叶苜蓿生物量积累与分配、抗氧化酶活性以及丙二醛含量的影响，同时分析了三者之间的耦合关系.结果表明，在轻度水分胁迫(土壤含水量为田间含水量的65%)下，新疆大叶苜蓿的总干物质量最高，POD、SOD和CAT活性最高；在重度水分胁迫(土壤含水量为田间含水量的45%)下新疆大叶苜蓿的根冠比和MDA含量最高.轻度水分胁迫下，根茎叶等生物量分配合理，总干物质量最高，植株生长健壮，并且在轻度水分胁迫下植物体内的抗氧化酶活性最强，清除自由基的能力最强.所以，轻度水分胁迫有利于增加新疆大叶苜蓿的产量和提高干旱半干旱区水资源的利用效率，同时也可以有效地抵御干旱环境，增强其抗旱能力.新疆大叶苜蓿在各个生育期的外在表现和内在机制与耐旱性关系紧密，具有一定的相关性.