添加发酵艾草构树叶混合物饲料对鲤鱼生长及免疫性能的影响

陈建军，张华杰，刘娜娜

(河南师范大学生命科学学院，河南 新乡 453007)

迅速增长的水产养殖使得水产养殖环境不断恶化，导致水产养殖疾病频发[1].而水产养殖疾病治疗所依赖的抗生素已经受到限制，并且抗生素的滥用也导致耐药菌株的出现，不仅对鱼类和人类健康产生不利影响，而且对水生环境也造成了严重的破坏[2-3].近三十多年来，抗生素的使用在养殖业中受到了很大的限制或者禁用，因此研究抗生素的替代品成为热点.通过多年研究，国内外普遍认可的能够代替或减少抗生素使用的饲料添加剂有益生菌、中草药等.益生菌可通过调节肠道微生物群和消化酶活性提高宿主动物的生长性能和抗病性.在水产养殖中，记录最多的益生菌包括乳酸菌，芽孢杆菌属和酵母菌.中草药是天然药物添加剂，含多种生物有效活性物质成分，有研究已证明了中草药在治疗水产动物的细菌性疾病有极好的效果[4].艾草中挥发性油类、黄酮类、三萜类等物质，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[5-6]；构树叶中粗蛋白质含量较高，常用于饲料添加以补充蛋白量，构树叶中含多种氨基酸，具有抗氧化抗肿瘤等作用，能够提高动物的免疫力[7].这2种中草药已在畜禽养殖中广泛应用，但在水产养殖中还未见报道[8].

益生菌和中草药作为饲料添加剂，在改善水产动物的生长性能和健康状况方面取得了显著的成果[9-11].很多研究者分别研究了益生菌和中草药在水产养殖中的机理.这2种添加剂的联合应用却很少受到关注.益生菌和中草药联合制剂即发酵中草药在畜禽养殖中已有应用，但在水产养殖中却很少报道.本试验首次研究饲料中添加益生菌发酵艾草构树叶混合物对鲤鱼免疫性能的影响，以期为发酵艾草构树叶在水产养殖中的应用提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用益生菌菌株(枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、屎肠球菌)均由河南师范大学生命科学学院微生物实验室提供；营养肉汤培养基及MRS培养基所用试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠(NaCl)、酵母浸粉、可溶性淀粉((C6H10O5)n)、乙酸钠(CH3COONa·3H2O)、柠檬酸铵(C6H5O7- (NH4)3)，磷酸氢二钾(K2HPO4)、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、一水硫酸锰(MnSO4·H2O)均为分析纯； 基础饲料购自河南大德农牧科技有限公司(营养水平为干物质88.71%，粗蛋白32.52%，粗脂肪为7.24%，粗灰分10.52%)；参照先前研究选择益生菌浓度为1×108CFU/g，发酵艾草构树叶混合物添加比例为0.4%[9,12-13].在基础饲料中添加益生菌(枯草芽孢杆菌∶地衣芽孢杆菌∶保加利亚乳杆菌∶屎肠球菌=1∶1∶1∶1)、艾草构树叶混合物(艾草∶构树叶=1∶1)和发酵艾草构树叶混合物分别制成益生菌饲料(A)、艾草构树叶混合物饲料(B)和发酵艾草构树叶混合物饲料(C)备用.

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物分组及免疫方案 鲤鱼从河南省新乡市延津某鱼场购买，并转移到水产学院温室养殖基地并将所有鱼用高锰酸钾浴处理，以每缸15条鱼，体质量为(50±3)g，放到12个80 L水缸中(持续1周)以适应环境.试验根据饲喂饲料不同设为4组(每组3缸)：对照组、益生菌组、艾草构树叶混合物组和发酵艾草构树叶混合物组，具体分组如表1所示.饲喂30 d后进行样品采集并在每组中随机选择30条鲤鱼(每缸10条)进行嗜水气单胞菌(2.51×108CFU/g)腹腔注射(1 mL/100 g)并统计成活率.

1.2.2 样品采集 每个试验组随机选取6条(每缸2条)进行心脏采血，并将其转移至无菌PE管中，4 ℃静置4 h，3 500 r/min离心10 min，吸取上清转移至新的无菌管中并保存于4 ℃，检测酶活待用.使用无菌剪和镊子取出脾脏保存于-80 ℃冰箱中待进行总RNA的提取和RT-PCR检测分析使用.

1.2.3 酶活力检测 检测血清中免疫相关的酶活所使涉及到的超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)及溶菌酶(LZM)均按照南京建成生物有限公司商用试剂盒说明书进行操作.

1.2.4 荧光定量检测 使用RNAiso Plus(TaKaRa，中国)裂解匀浆组织细胞提取总RNA，定量用分光光度法评估纯度，并用cDNA反转录试剂盒(TaKaRa，中国)反转录成cDNA.使用罗氏 LightCycler 96 PCR仪通过实时PCR分析免疫基因IL-6、IL-10、TNF-α、LZM的表达，总体积为10 μL，包含SYBR Fast qPCR Mix(TaKaRa，中国)，特殊引物(5 μL)，cDNA和无菌双蒸馏水.程序是在95 ℃下持续600 s，然后执行45个循环，分别是95 ℃下15 s和60 ℃下60 s.在扩增阶段之后进行熔解曲线以确认.每个样品重复3次.40 s rRNA作为内参基因.使用2-ΔΔCT方法研究了脾脏中免疫基因的相对表达水平.用于基因分析的引物序列见表2.

1.3 数据处理

表1 试验设计与分组

2 结果与分析

2.1 非特异性免疫反应

与对照组相比，添加剂各组鲤鱼血清中AKP和ACP酶活性组升高，其中，添加剂组AKP显著升高，且各组间无显著差别(P>0.05)；艾草构树叶混合物组和发酵艾草构树叶混合物组ACP显著升高(P<0.05).而对于溶菌酶，添加剂组相较于对照组虽有升高但不显著(P>0.05).结果表明添加剂组的鲤鱼相对于对照组免疫力提高，如图 1所示.

添加益生菌和发酵艾草构树叶混合物组的髓过氧化物酶比对照组显著升高(P<0.05)，而SOD酶活在各添加剂组中没有显著性变化(P>0.05)，说明血清中抗氧化能力有所改善，如图2所示.

表2 引物序列

图1 饲喂30 d后鲤鱼血清中AKP、ACP、LZM活性Figure 1 AKP,ACP,LZM activities in carp serum after 30 days of feeding

图2 饲喂30 d后鲤鱼血清中SOD、MPO活性Figure 2 SOD and MPO activities in carp serum after 30 days of feeding

2.2 免疫相关的基因在脾脏中的表达

如图3所示，IL-10在脾脏中，添加剂组均高于对照组，其中益生菌组和发酵艾草构树叶混合物组显著高于对照组和艾草构树叶混合物组(P<0.05)，而与之相反的是IL-6在脾脏中的表达量添加剂组均降低，且益生菌组和发酵艾草构树叶混合物组显著低于对照组和艾草构树叶混合物组(P<0.05).而TNF-α在脾脏中的表达与IL-6相似，这种结果可能与益生菌有关.

溶菌酶在脾脏中的表达结果表明，添加剂组均显著高于对照组(P<0.05)，且添加剂组间存在显著差异性，益生菌组>发酵艾草构树叶混合物组>艾草构树叶混合物组(图4).这种结果可能与益生菌分泌抗菌肽等活性酶有关，艾草构树叶混合物中含有的生物活性物质对抗原也有一定的作用.

图3 IL-10、IL-6、TNF-α在脾脏中的表达Figure 3 IL-10,IL-6,TNF-α expression in the spleen

图4 LZM在脾脏中的表达Figure 4 Lysozyme expression in the spleen

2.3 抗病性检测

用嗜水气单胞菌攻击鲤鱼统计10 d内的存活率如图5所示.对照组在第2天观察到鱼死亡，在注射后第3天对照组、益生菌组及艾草构树叶混合物组出现死亡.在注射第5天后各组无死亡出现.在10 d的攻击试验结束时，饲喂益生菌、艾草构树叶混合物和发酵艾草构树叶混合物的鱼的累积存活率均高于饲喂基础饲料的鱼，结果如图5所示.

3 讨论

人们为了在有限空间内扩大水产养殖，增加收入，频繁使用抗生素以提高水产动物的免疫性能，而现在抗生素逐渐禁用或限制之后，具有提高免疫力的替代饲料添加剂就受到了特别关注.因此，益生菌和中药的组合已显示适合于此目的.本次试验研究结果显示在饲喂30 d后，添加剂组非特异性免疫要优于对照组.非特异免疫是鱼类免疫的第一道防线[14].碱性磷酸酶(AKP)、碱性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LZM)等属于非特异免疫酶，在对外来抗原的识别、清除以及调节体内平衡具有重要作用，是非特异性免疫性能的重要指标.试验结果中溶菌酶(LZM)无显著变化可能是未受到细菌性抗原的刺激，而添加剂组碱性磷酸酶(AKP)和碱性磷酸酶(ACP)酶活显著高于对照组，可能是饥饿24 h以及采血过程中使鲤鱼产生应激反应，使得添加剂组中的鲤鱼快速激活碱性磷酸酶(AKP)和碱性磷酸酶(ACP).韩永峰等[15]采用甘草和复方五倍子饲喂黄河鲤12 d后，使用嗜水气单胞菌攻击黄河鲤，检测结果也显示了处理组的碱性磷酸酶(AKP)和碱性磷酸酶(ACP)酶活显著高于对照组，溶菌酶也显著升高.苏岭等[16]用复方中药熬汁每天灌服鲤鱼，在接受细菌性抗原刺激后AH组鱼的碱性磷酸酶 (AKP)含量显著升高.这与本试验结果相一致.由此可以证明添加益生菌、艾草构树叶混合物及发酵艾草构树叶混合物可以显著提高鲤鱼的非特异性免疫反应.

图5 嗜水气单胞菌攻击鲤鱼后10 d内的成活率Figure 5 The survival rate within 10 days after Aeromonas hydrophila challenged carps

关于添加益生菌、艾草构树叶混合物和发酵艾草构树叶混合物对鲤鱼抗氧化能力的影响，本试验中添加益生菌和发酵艾草构树叶混合物组的髓过氧化物酶(MPO)的活性则显著高于对照组.这可能是益生菌和发酵艾草构树叶混合物内一些中药降解产物在一定程度上提高了鲤鱼的非特异性免疫机能.此外，MPO是中性粒细胞的功能及激活标志，其主要功能是利用过氧化氢和氯离子产生次氯酸盐，并形成具有氧化能力的自由基，对机体产生和调节炎症反应等多方面发挥作用[17].Seunghan等[18]在日本鳗鱼日粮中添加益生菌和益生元饲喂8周后检测到血清中髓过氧化物酶(MPO)比对照组显著升高，这与本试验结果一致；而对于超氧化物歧化酶(SOD)结果也类似，虽有升高但相较于对照组并不显著.谢炎福用0.1%的益生菌发酵复方中药饲喂黄河鲤检测到超氧化物歧化酶(SOD)结果和本试验结果相似[9]，而0.3%的益生菌发酵复方中药组比对照组显著升高.由以上可以推断可能是本试验中益生菌添加量过低，不足于对机体SOD活力产生显著影响.本试验结果表明，在饲料中添加益生菌、艾草构树叶混合物、发酵艾草构树叶混合物对鲤鱼抗氧化能力有一定影响.

鱼类的脾脏中含有大量淋巴细胞，与鱼类的体液免疫即特异性免疫密切相关，仅次于头肾[19]；而之前研究通常以头肾研究为主，而对脾脏的研究很少[20].本试验对添加发酵艾草构树叶混合物对鲤鱼脾脏中免疫相关基因进行了初步探究，结果发现益生菌和发酵艾草构树叶混合物组中溶菌酶比艾草构树叶混合物组显著升高可能是益生菌分泌酶类产物使得溶菌酶表达水平升高，中药中含有的黄酮类物质具有一定的抑菌杀菌作用但未经过发酵某些成分无法发挥作用.益生菌组和发酵艾草构树叶混合物组比另外两组的IL-10基因表达水平显著升高，IL-6和TNF-α的表达水平则相反.可能是溶菌酶已将有害物溶解或杀死，巨噬细胞未被激活，因此促炎因子IL-6和TNF-α表达被抑制，相反，抑炎因子IL-10表达升高.中药组可能是未发酵的中药中含有某些能够被益生菌降解的物质对鲤鱼有一定的毒性作用引起了巨噬细胞的激活.鲤鱼抗嗜水气单胞菌挑战试验中发酵中药组成活率最高，其次是益生菌和艾草构树叶混合物组，对照组最低，这一结果也证明了酶活和基因表达变化结果.

4 结论

在饲料中添加益生菌、艾草构树叶混合物和发酵艾草构树叶混合物能够显著鲤鱼的免疫性能，且发酵艾草构树叶混合物效果最优.