肝细胞癌源血液相关外泌体组分通过补体和凝血级联参与肿瘤组织天然免疫

凌玉金 唐玉莲 倪安妮 廖成传 刘明慧 梁祯妮 李曙波 陆瑞群 李根亮

右江民族医学院,广西百色市 533000

肝细胞癌是威胁人类健康最主要的消化系统恶性肿瘤之一[1-2]。据最新的中国恶性肿瘤发病和死亡分析报告，我国肝细胞癌发病率已居恶性肿瘤第4位[3]。外泌体是细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡，其可通过血液等体液远距离运输，靶向作用于细胞和组织，参与抗原提呈、天然免疫以及肿瘤的发生发展等各方面。刘树业[4]在HCC中发现，外泌体可通过调控HCC肿瘤微环境的耐受情况影响机体的免疫反应。袁正宏[5]在病毒感染机体的过程中亦证明了，外泌体在激活机体免疫反应等方面的突出作用。可见，外泌体在HCC组织中的免疫反应作用逐渐被发现。但是，外泌体参与HCC组织免疫反应的机制机理还有很多地方不清楚，特别是血液相关外泌体在HCC肿瘤组织天然免疫方面的作用目前尚未见报道。

据此，本研究以HCC模型小鼠的瘤体组织和癌旁肝组织为实验材料，提取各组织中的总RNA，通过RNA-seq和生物信息学手段，分析HCC组织中参与天然免疫反应的肝细胞癌源血液相关外泌体差异表达基因及其功能，并用RT-qPCR验证实验结果。通过对差异表达基因分析，探讨HCC来源血液相关外泌体组分参与天然免疫反应的可能机制，为临床肿瘤预防和诊治提供帮助作用。

1 材料和方法

1.1 动物模型构建和样本获取 鼠龄7周、体重22～25g的健康昆明小鼠100只，随机分成2组，即肝癌模型小鼠组(60只)和对照组(40只)。对照组用于判断肝癌模型小鼠建立是否成功。方法：给予肝癌模型小鼠组每只小鼠双前肢腋下接种0.2ml肝癌细胞系H22细胞(指数增长期细胞，细胞悬液浓度为105个/ml)，对照组同法生理盐水注射。正常饲养4周后，分别取成瘤小鼠瘤体组织和癌旁肝组织，各自等量混合制成混合样本。

1.2 样本RNA提取及RNA-seq 采用RNA提取试剂盒(Invitrogen，中国上海)，分别提取瘤体组织和癌旁肝组织样本中总RNA，送公司进行RNA-seq分析以获得两类样本中差异表达基因。RNA-seq质量检测及clean reads筛选按常规程序完成。差异表达基因以两类样本中同一基因之间的RPKF值(每百万测序碱基中或每千个转录子测序碱基中所包含的测序片断数)比值≥2或≤0.5，且FDR(错误发现率)值≤0.05的基因为有统计学意义。

1.3 HCC源血液相关外泌体差异表达基因的筛选 以“blood、exosome or exosomal、protein、Innate immunity和Mus musculus”作为关键词，在NCBI中的Nucleotide数据库中进行HCC源血液相关外泌体基因检索。将检索结果与测序数据中的差异表达基因进行比对，筛选出差异表达的HCC源血液相关外泌体基因。

1.4 参与天然免疫反应的HCC源血液相关外泌体差异表达基因的筛选 利用DAVID 6.8软件对差异表达的HCC源血液相关外泌体基因进行功能富集，筛选出参与天然免疫反应的HCC源血液相关外泌体差异表达基因，以FDR≤0.05的基因为有统计学意义。

1.5 参与天然免疫反应的HCC源血液相关外泌体差异表达基因的功能分析 利用DAVID 6.8软件对参与天然免疫反应的HCC源血液相关差异表达基因进行在线基因注释及功能富集，以进行GO和KEGG分析。

1.6 参与天然免疫反应的HCC源血液相关差异表达基因的编码蛋白互作分析 通过STRING数据库对参与天然免疫反应的HCC源血液相关差异表达基因的编码蛋白进行互作分析，以评价差异基因在分布和功能上的相关性。

1.7 SNV/INDEL与基因表达的相关性分析 利用Excel软件对参与天然免疫反应的HCC源血液相关差异表达基因中出现的单核苷酸位点变异(Single nucleotide variants，SNV)及核苷酸插入/删除(INDEL)情况进行分析，探讨其多态性与基因表达异常的相关性。

1.8 RT-qPCR验证 随机选择4个参与天然免疫反应的HCC源血液相关差异表达基因进行RT-qPCR分析，内参基因为β-actin。引物采用Blast-primer软件进行设计，由上海生工公司合成。

2 结果

2.1 参与天然免疫反应的HCC源血液相关外泌体差异表达基因的筛选结果 通过筛选比对，在健康肝组织和癌旁肝组织中发现了81个参与天然免疫反应的差异表达的HCC来源血液相关外泌体基因。随机选取的4个差异表达基因RT-qPCR分析结果与RNA-seq结果中的表达趋势一致，见图1。RT-qPCR引物见表1。

图1 RT-qPCR与RNA-seq检测参与天然免疫反应的HCC来源血液相关外泌体基因的表达情况比较

表1 基因RT-qPCR引物

2.2 参与天然免疫反应的HCC源血液相关外泌体差异表达基因的功能 对81个差异表达基因功能富集，共富集到10个生物学过程(BP)、4个细胞组分(CC)、3个分子功能(MF)和2个KEGG通路(KEGG)。进一步分析这些基因功能，发现它们主要富集在天然免疫反应(39个基因)、血液凝固(25个基因)、炎症反应(18个基因)、受体结合(16个基因)、丝氨酸型内肽酶活性(16个基因)、丝氨酸型肽酶活性(12个基因)等方面，以及补体和凝血级联(33个基因)等信号通路上，见图2和图3。

2.3 参与天然免疫反应的HCC源血液相关外泌体差异表达基因的编码蛋白互作 参与天然免疫反应的HCC来源血液相关外泌体基因的编码蛋白互作情况也表明了这些基因功能密切相关，见图4。

2.4 SNV/INDEL与基因表达的相关性 SNV/INDEL的分析结果显示，参与天然免疫反应的HCC来源的81个血液相关外泌体基因共发生了387个SNV和8个INDEL位点的改变。这些基因位点的改变主要发生在基因的6个部位，即外显子区(exonic)、内含子区(intronic)、基因间区(intergenic)、基因下游区(downstream)、基因上游区(upstream)及拼接区(splicing)，其中外显子区、内含子区及基因间区3个区域发生这些位点多态性概率最大，见图5。

图2 参与天然免疫反应的HCC源血液相关外泌体差异表达基因的功能

图3 天然免疫反应的HCC源血液相关外泌体差异表达基因参与的补体和凝血级联信号通路

图4 参与天然免疫反应的HCC来源血液相关外泌体差异表达基因的编码蛋白互作

图5 参与天然免疫反应的HCC来源血液相关外泌体基因的SNV和INDEL分布

3 讨论

外泌体是远程细胞信号传导的重要载体。在肿瘤组织中，新肿瘤的发生发展与富含多种来自亲代肿瘤活性成分的肿瘤源外泌体有紧密联系[6-7]。肿瘤源外泌体通过树突状细胞将肿瘤特异性抗原提呈给CD8+T细胞激发杀伤作用，在抗肿瘤免疫中起重要作用[8]。可见，外泌体与机体的免疫反应有密切联系。在本研究中，我们发现81个参与天然免疫的HCC源血液相关外泌体基因。这些基因富集到的功能主要包括天然免疫反应、血液凝固、炎症反应、受体结合等。这表明，我们的研究与其他研究者有同样的发现,并且我们在富集到的功能中，还发现其中有33个HCC源血液相关外泌体差异表达基因还参与了补体和凝血级联信号通路。

凝血系统作为机体免疫应答的重要组成部分发挥功能[9]。病原体感染机体会同时激活凝血系统引起血液凝固，血液凝固会进一步限制病原体入侵机体。生物普遍存在的补体和凝血级联系统以维持天然免疫的激活[9]。这表明补体和凝血级联与天然免疫有很密切的关系。但补体和凝血级联与肿瘤源性外泌体的相互作用的报道较少。有报道，肺癌病人外泌体中的补体蛋白C4a在血浆内的表达量明显高于良性病人[10]。我们研究发现33个基因参与了补体和凝血级联信号通路，这进一步补充了肿瘤源性外泌体与补体和凝血级联的密切关系。

那么，血液相关外泌体基因在肿瘤天然免疫中具体有何作用？Huber等[11]发现血液中血小板源性外泌体对凝血途径的激活作用是外泌体在凝血级联系统中的主要表现形式之一。约50%恶性肿瘤患者和90%恶性肿瘤转移的患者凝血系统指标发生不同程度的异常[12]。肿瘤患者机体凝血、抗凝纤溶系统发生失衡，导致血液处于高凝状态[13]。本研究发现的肝细胞癌源血液相关外泌体组分，从富集到的功能基因的数量上看，HCC源血液相关外泌体组分很可能主要以受体结合、丝氨酸型肽酶催化活性等，通过补体和凝血级联信号途径，参与HCC组织中的天然免疫反应。在远离原病灶的组织中通过激活补体和凝血级联信号途径参与防御癌细胞扩散和入侵的天然免疫反应抑制癌细胞的增殖。我们进行的差异基因的SNV/INDEL的分析表明，基因的多态性还很可能在HCC中扮演着重要的调控作用。

综上所述，本研究探索了HCC来源血液相关外泌体基因参与天然免疫的可能机制，发现HCC源血液相关外泌体组分可能主要以受体结合、丝氨酸型肽酶活性等，通过补体和凝血级联信号途径参与天然免疫反应，从而在抑制癌细胞的增殖过程中发挥重要作用。