青霉素G钾在蔬菜地土壤中的降解动力学研究

张紫琴，张洪昌，沈根祥,*，胡双庆，顾海蓉，赵晓祥,#

1. 东华大学环境科学与工程学院，上海 201620 2. 上海市环境科学研究院，上海 200233

自被发现以来，青霉素就作为治疗人类和动物传染病的药物被广泛使用，同时也作为一种添加剂在促进动物生长方面广泛应用[1-3]。Chen等[4]和Klein等[5]研究了包括中国在内的76个国家在2000—2015年抗生素的消费趋势，结果表明，抗生素的消费总量增加了65%，至2015年广谱青霉素占抗生素消费总量高达39%。2013年，我国兽用抗生素消费量约占抗生素总消费量的52%[6]。研究表明，兽用抗生素进入动物体内后不能被动物完全吸收，大约有50%～90%的抗生素会以原药或其代谢物的形式排出[7-8]。而目前畜禽粪尿还田是最常用的畜禽粪污处理方法，粪尿中的抗生素也会随着还田过程进入农田、水体环境并富集到生物体中，从而对环境微生物群落和人体健康产生危害[9-10]。在所有的抗生素种类中，四环素和青霉素是最常用的2种兽用抗生素[11]。

抗生素在土壤中的降解动力学研究以磺胺类、喹诺酮类和四环素类较多[12-14]，而β-内酰胺类抗生素虽然在土壤及有机肥中常被检出，浓度范围在0.62～12 mg·kg-1[15-17]，但其降解动力学研究主要集中在牛奶和废水等基质中[18-21]，在土壤中的研究鲜见报道。马静静[17]检测了内蒙古牧区12个土壤样品中的青霉素，其中，阳性样本占50%，检出浓度最高为1.88 mg·kg-1。刘燕等[16]指出江苏省南京市横溪镇农田土中青霉素残留浓度为2 mg·kg-1。段子恒[15]的研究表明，某制药厂提供给西红柿种植的青霉素菌渣肥(处理后)中青霉素浓度为12 mg·kg-1。Li等[22]的研究表明，制药废水经过厌氧、水解及2个好氧单元处理，大部分的青霉素G可以被除去，最终浓度为μg·L-1量级，且其在地表水中的主要降解产物为青霉噻唑酸(penilloic acid)、中间体青霉氧酸(penicilloic acid)和青霉二酸异构体(isopenillic acid)。

因此，本文选取畜禽养殖业中常用的典型β-内酰胺类抗生素——青霉素G钾作为目标抗生素，研究其在灭菌及未灭菌的蔬菜地土壤以及添加有机肥土壤中的降解行为，并使用一级动力学方程和二级动力学方程来拟合，为防止抗生素对环境造成污染提供依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验试剂与材料

试剂：青霉素G钾(penicillin G potassium, PG)标准品(纯度>97%)、内标物氘代青霉素G钾盐(penicillin G-d5 potassium salt, phenyl-d5)标准品(纯度98.7%)，均购于德国Dr. Ehrenstorfer公司；本实验中用到的甲醇、乙腈和甲酸等均为色谱级试剂，其中，有机溶剂购于美国Tedia公司，甲酸购于德国CNW科技公司；磷酸、磷酸二氢钠为分析纯，购于上海润捷化学试剂有限公司；实验室用水为Milli-Q超纯水。将青霉素G钾标准品用甲醇溶解配制为500 mg·L-1的标准储备液，避光保存在4 ℃冰箱中。

磷酸盐缓冲溶液：称取24.0 g磷酸二氢钠，用超纯水定容至1 L，用磷酸调节溶液pH至3.0。

供试土壤及有机肥：本实验所用土壤采自上海市金山区的一块空白实验蔬菜地(121.278933°W, 30.788379°N)，该地在之前的5年内未施用有机肥，采集农田表层土壤(深度0～20 cm)带回，经自然风干后，去除植物残根及沙砾，磨碎过10目筛，保存在4 ℃环境中。有机肥采集自沁侬猪场自然堆肥18 d后的猪粪，保存在-20 ℃环境中。所用土壤及有机肥均未有目标抗生素检出，理化性质如表1所示。

表1 供试土壤的基本理化性质Table 1 The basic physical and chemical properties of the soil

仪器与材料：Waters Xevo TQ-S Micro高效液相色谱串联质谱仪(美国Waters公司)，色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C18 collumn(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm) (美国Waters公司)；CEM MARS CLASSIC高压微波消解萃取仪(美国CEM公司)；YXQ-LS-50G立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)；Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪(厦门睿科仪器有限公司)；AUTO-EVA全自动氮吹浓缩仪(厦门睿科仪器有限公司)；Oasis®HLB 60 μm (6 mL, 500 mg)固相萃取柱(美国Waters公司)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；LDG-0.3C低温真空冷冻干燥机(上海昊博低温真空设备有限公司)。

1.2 降解实验

1.2.1 青霉素G钾在灭菌及未灭菌蔬菜地土壤中的降解实验

准确称取(50.000 ± 0.0001) g(干重)过筛土壤于100 mL烧杯中，设置灭菌组和未灭菌组。灭菌组在121 ℃条件下湿热灭菌3次，间隔时间为24 h。将抗生素的甲醇稀释液加入到土壤中，充分混匀，使土壤中的其初始浓度分别为1、5和10 mg·kg-1，然后将烧杯置于通风橱下24 h，待载体溶剂甲醇挥发干后，用灭菌后的超纯水调节土壤湿度为30%。最后，将样品用保鲜膜封口，在保鲜膜上保留通气孔，且用铝箔纸包裹置于20 ℃恒温培养箱中培养，隔天称重并补充样品损失水分，每天摇晃以鼓入空气，维持好氧条件。在培养的第0、1、3、5、7、14、21、28、35和42天破坏性取样，测定土壤样品中抗生素的残留量，并记录。

1.2.2 青霉素G钾在添加与未添加有机肥蔬菜地土壤中的降解实验

中国有机农业网发布的要使蔬菜地大棚的土壤有机质保持在1.5%的水平，对于150 000 kg耕作层土壤而言，每年施入的有机质至少应为450 kg，根据有机肥的有机质含量(12%)设定混合基质中土壤与有机肥的质量比为1∶0.025，有机肥在培养的第0天一次性添加，即准确称取50 g土壤(干重)和1.25 g有机肥(干重)于100 mL烧杯中。剩余实验过程与1.2.1中一致。

1.3 样品提取与净化

将土壤样品真空低温冻干后，研磨过20目筛，准确称取(1.000 ± 0.0001) g于100 mL微波萃取管中，加入10 μL 5 mg·L-1的内标物，加入50 mL乙腈-磷酸盐缓冲液(V∶V= 1:1)，于65 ℃条件下微波萃取30 min。后续抗生素提取液的富集净化步骤参考汪仙仙等[7]的方法。

1.4 样品检测分析

目标抗生素的定性和定量分析通过高效液相色谱串联质谱仪来实现。液相色谱条件：流动相A为0.5%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.35 mL·min-1，进样量为2 μL。梯度洗脱程序为：0～2.2 min，84% B；2.2～5.5 min，84%～5% B；5.5～6.0 min，5%～84% B；6.0～9.0 min，84% B。质谱条件：采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，扫描方式为多反应离子检测(MRM)，毛细管电压为3 kV，脱溶剂气温度为500 ℃，脱溶剂气流速为1 000 L·h-1。用甲醇将抗生素储备溶液逐级稀释成不同系列的浓度，设置标准曲线范围为1.37～500 μg·kg-1，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，绘制标准曲线。目标抗生素的母离子、子离子、标准曲线、定量限、检测限和加标回收率等参数如表2所示。

1.5 数据分析

数据为3次平行实验的算术平均值，实验结果由Origin 2017进行一级动力学方程、二级动力学方程拟合，显著性分析采用单因素方差分析。

(1)降解实验数据拟合一级降解动力学方程：Ct=C0e-kt

表2 目标抗生素的标准曲线、检测限、定量限和加标回收率Table 2 The standard curves, detection limits, quantitative limits and recoveries of antibiotics

式中：C0为土壤中抗生素初始浓度，mg·kg-1；Ct为时间为t时土壤中抗生素浓度，mg·kg-1；t为时间(d)；k为降解速率常数(d-1)；η为降解速率(mg·kg-1·d-1)。

2 结果(Results)

2.1 灭菌与未灭菌对土壤中抗生素降解的影响

以青霉素G钾初始浓度为10 mg·kg-1为例，培养周期内土壤中抗生素的残留量和降解速率变化如图1(a)、1(c)所示(降解速率由拟合后一级反应动力学的参数计算得出)。在未灭菌的土壤中，实验第0、1、3、5和7天的降解速率分别为4.32、2.83、1.22、0.53和0.23 mg·kg-1·d-1，在第7天，抗生素的降解率>97%，已基本降解完全。7 d后降解速率<0.01 mg·kg-1·d-1，实验结束后，青霉素G钾在土壤中的最终浓度为29.8 μg·kg-1。在灭菌土壤中，实验第0、1、3、5和7天的降解速率分别为1.53、1.31、0.96、0.70和0.52 mg·kg-1·d-1，在第7天，抗生素的降解率<60%，7 d后仍以较快速度继续降解，到14 d时降解速率为0.06 mg·kg-1·d-1(降解率为94%)，实验结束后，抗生素的最终浓度为22.6 μg·kg-1。

灭菌与未灭菌土壤、不同初始浓度的青霉素G钾的降解动力学计算结果如表3所示。结果表明，在本实验的浓度范围内(1～10 mg·kg-1)，一级动力学方程和二级动力学方程均能很好地拟合实验结果，一级动力学方程拟合相关系数(r2)在0.951～0.997之间，二级动力学方程拟合相关系数(r2)在0.85～0.975之间，降解速率与抗生素的初始浓度有关。由表3可知，青霉素G钾在灭菌土壤中的半衰期在4.48～6.48 d之间，在未灭菌土壤中的半衰期在1.61～1.67 d之间。青霉素G钾在灭菌土壤中的半衰期显著高于未灭菌土壤，表明微生物与其他非生物因素在抗生素的降解中发挥着重大的作用，且抗生素在土壤中的半衰期较短(<7 d)，在环境中易分解而不易残留和转移。

表3 PG在灭菌和未灭菌土壤上的降解动力学参数Table 3 Kinetic parameters for the degradation of PG in sterile and non-sterile soils

2.2 添加有机肥对土壤中抗生素降解的影响

培养周期内青霉素G钾在添加有机肥土壤中的残留量和降解速率变化如图1(b)、1(d)所示(降解速率由拟合后一级反应动力学的参数计算得出)。以青霉素G钾初始浓度为10 mg·kg-1为例，可以看出，土壤中青霉素G钾的浓度随时间逐渐降低，在培养的前7天，抗生素快速降解，第0、1、3、5和7天的降解速率分别为3.71、2.61、1.29、0.64和0.32 mg·kg-1·d-1，降解在第7天之后趋于平缓。在实验第7天，土壤中青霉素G钾的浓度为0.07 mg·kg-1，降解率为99.3%，在实验结束后，抗生素的浓度为28.7 μg·kg-1。

添加有机肥土壤中不同初始浓度的青霉素G钾的降解动力学计算结果如表4所示。结果表明，在本实验的浓度范围内(1～10 mg·kg-1)，一级动力学方程和二级动力学方程均能很好地拟合实验结果，一级动力学方程拟合相关系数(r2)在0.91～0.978之间。由表4可知，青霉素G钾在添加了有机肥蔬菜地土壤中的半衰期为1.85～2.39 d。

图1 PG在蔬菜地土壤中残留量和降解速率随时间的变化注：图中1、5和10分别表示土壤中PG的初始浓度为1、5和10 mg·kg-1；(a)、(c)表示PG在灭菌与未灭菌组土壤中的残留量和降解速率，(b)、(d)表示PG在施加有机肥与未施加有机肥组土壤中的残留量和降解速率。Fig. 1 Residue and degradation rates of PG in vegetable soilNote: 1, 5 and 10 denote the initial concentration of 1, 5 and 10 mg·kg-1 for PG in soil, respectively; (a) and (c) denote residue and degradation rates of PG in sterile and non-sterile soil; (b) and (d) indicate residue and degradation rates of PG in compost and compost-free soil.

表4 PG在添加有机肥土壤中的降解动力学参数Table 4 Kinetic parameters for the degradation of PG in vegetable soils with compost

3 讨论(Discussion)

青霉素G钾在未灭菌土壤和灭菌土壤中的降解存在着显著差异(P<0.05)，未灭菌土壤中青霉素G钾的降解速率快于灭菌土壤，且无论是灭菌土壤还是未灭菌土壤，青霉素G钾的降解都呈现先快后慢的趋势，最后趋于平衡，青霉素G钾会以一个很低的水平(小于兽药国际协调委员会提出的生态毒害效应触发值100 μg·kg-1)在土壤中存在很长时间，可能会存在诱导土壤中抗性基因的产生及转移的风险[23]。研究表明，青霉素G钾在土壤中的降解由生物与非生物共同作用所致。这一结果与Andreozzi等[24]研究阿莫西林的降解工艺包括非生物(水解)和生物(活性污泥中的生物降解)一致。Liu等[25]研究好氧堆肥过程中阿莫西林的降解也得出类似结论，阿莫西林的降解过程中β-内酰胺环的开环受到生物和非生物因素的共同影响。

相同实验时间和相同处理条件下，不同浓度的抗生素降解速率表现出显著不同(P<0.05)，抗生素初始浓度越高，降解速率越快，但不同初始浓度的抗生素在土壤中降解的半衰期基本一致，最终降解程度也无明显差异，即污染水平对抗生素的半衰期无明显影响，进入环境中的青霉素G钾能很快降解(参考POPs国际公约中关于化学品持久性的定义，有机物在土壤中的半衰期小于1个月的为易降解)，但由于青霉素在畜禽养殖业中的大量使用，导致青霉素源源不断地进入到环境中，造成假性持久性污染。Zhang等[26]研究初始浓度为898.51 mg·kg-1的青霉素菌渣与猪粪共堆肥时，发现青霉素的半衰期为1.7 d，在堆肥混合料中添加青霉素发酵菌渣对堆肥过程没有影响，甚至对堆肥中微生物的活性没有促进作用。与本实验结果相反，Yang等[27]研究磺胺嘧啶在土壤中的降解情况时，设置了1、10和25 mg·kg-13个浓度，发现其半衰期分别为2、18和34 d，认为高浓度的磺胺嘧啶抑制了土壤中的微生物活性，影响到了抗生素的降解过程。Selvam等[28]研究四环素的降解时也发现了类似结果，四环素的半衰期为11.5 d。因此，可以假设，由于青霉素降解速率快，半衰期短，其初始浓度对细菌种群的影响较小且非生物作用在青霉素的降解过程中起着重要的作用。

运用SPSS 24对实验期内抗生素在未添加有机肥土壤和添加有机肥土壤的残留量数据进行单因素方差分析，发现2组数据差异不明显(P>0.05)。可能是由于本实验用的是堆肥18 d后的有机肥，每单位干重有机肥的碳、氮含量低于动物鲜粪[29]，且添加有机肥比例较小，实验期内土壤碳源充足，导致所添加有机肥不能有效地增加土壤中微生物的数量，对土壤中抗生素的生物降解影响较小。实验结束后，2种土壤中青霉素G钾含量均<30 μg·kg-1，差异不大，表明在当前添加有机肥的含量下，对抗生素的最终降解率不产生明显影响。

抗生素在土壤中的降解，除生物降解以外，还有其他因素的影响，如抗生素的理化性质、土壤的理化性质及环境因素等[30-33]。本实验在避光环境下进行，光照对于抗生素降解的影响可忽略不计，因此，非生物降解主要考虑水解和土壤理化性质影响。研究表明，β-内酰胺类抗生素结构中的β-内酰胺环不稳定，在环境中容易受酸碱度、二价重金属离子、羟基离子和β-内酰胺酶的影响，发生酰胺键断裂开环，使得抗生素发生降解[25,34-35]。青霉素类抗生素在酸性、中性和碱性环境中，均能发生水解反应，β-内酰胺环开环[36]，有些金属离子，例如Chen等[37]研究发现，Fe3+能与氨苄西林的羧基和叔氮配位，促进抗生素的水解反应。王伟杰和贾励瑛[38]研究头孢克洛的水解行为，发现温度在25～45 ℃内，抗生素水解率随温度升高而增大，推测是温度的升高加速了水解反应的进行。章明奎等[39]研究4类抗生素在10种不同土壤中的降解行为，结果表明，土壤粘粒含量和氧化铁含量与降解率呈显著负相关关系，土壤有机质含量轻微影响抗生素降解率，土壤pH和阳离子交换量几乎不影响抗生素降解率。

综上，本研究表明，青霉素G钾在土壤中的降解速度很快，7 d内降解率达到97%以上。本实验周期内(42 d)青霉素G钾以较低的水平(<100 μg·kg-1)在土壤中长期存在且难以降解完全；青霉素G钾在灭菌与未灭菌蔬菜地土壤的降解曲线显示，其降解过程受生物和非生物作用共同影响。动力学拟合方程表明，青霉素G钾的降解速率与浓度呈正相关，但其半衰期与浓度无显著关系(1.61～1.67 d)；按质量比1∶0.025(土壤∶有机肥)添加自然堆肥18 d后的猪粪不改变青霉素G钾的最终降解率，且降解过程和未添加有机肥组无显著差异。