防污漆活性物质敌草隆和辣椒素对大型溞的急性和慢性毒性效应

陈进林，许玉洁，高亮，蔡佳宏，梁嘉慧，余明喧，肖亿金，陈桂兰，冯宝欣，霍嘉维，梅承芳,#，曾国驱,*

1. 广东省微生物研究所，广东省微生物分析检测中心，广东省科学院，广州 510070 2. 华南应用微生物国家重点实验室，广州 510070 3. 广东省菌种保藏与应用重点实验室，广州 510070 4. 广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070

敌草隆(diuron)是一种常用的典型防污漆活性添加剂，也是一种抑制植物光合作用的除草剂[1]，其水解、光解和生物降解的半衰期均较长，有环境持久性[2]。由于长期广泛的使用，近年来，敌草隆在地表水、海洋环境中被频繁检出，对环境和人类健康存在一定的潜在风险[3-4]。有研究表明，敌草隆对水生生物有一定的生态毒性，其中，藻类是对其最为敏感的物种，并且随着食物链的传递可在鱼类和甲壳类生物体内蓄积[1]。Mansano等[5]的研究表明，敌草隆对月牙藻(Raphidocelissubcapitata)的96 h半数抑制浓度(IC50)为10.4 μg·L-1，对近具刺链带藻(Desmodesmussubspicatus)的72 h-IC50为46.3 μg·L-1[6]，显示出极高的毒性。Nebeker和Schuytema[4]的研究表明，敌草隆对枝角类、端足类、摇蚊、鱼类、蚯蚓和螺都有一定的慢性毒性，其中，对蚤状溞(Daphniapulex)繁殖抑制的7 d最低可观察效应浓度(LOEC)为7.7 mg·L-1，无可观察效应浓度(NOEC)为4.0 mg·L-1；对黑头呆鱼幼鱼的10 d半致死浓度(LC50)为27.1 mg·L-1。目前，标准化的测试要求更长生命周期的慢性毒性数据[7-8]，以支撑对化学品的环境风险评估。但是，敌草隆对水生甲壳纲枝角类更长生命周期的慢性毒性研究，却鲜见有报道。

近年来，研究人员一直在探索无毒或低毒、对环境更友好的防污漆活性物质，以替代目前常用的高毒性的物质，其中一个研究方向是将低毒、具有杀生活性的天然产物添加于防污漆中[9]。辣椒素(capsaicin)被认为是最具潜力的天然防污漆活性添加剂之一，有研究者认为，与现有防污漆添加剂相比，辣椒素具有很多优势特性[10-13]。LaHann等[14]的研究表明，辣椒素的辛醇-水分配系数比较低(logKow= 3.04)，表明其不太可能具有生物蓄积性。辣椒素还具有快速生物降解性，对羊角月牙藻生长抑制的72 h半数效应浓度(EC50)为5.114 mg·L-1，对斑马鱼的96 h-LC50为5.98 mg·L-1[9]。Angarano等[12]的研究表明，辣椒素对大型溞的LC50为18.3 mg·L-1。所以，辣椒素对水生生物具有一定的急性毒性。Oliveira等[15]的研究表明，1 mg·L-1的辣椒素对莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的生长、大型溞的急性活动和斑马鱼胚胎的死亡率均没有显著影响，但可以显著提高胚胎心脏的心率，因此，研究辣椒素在低浓度长期暴露下对水生生物的慢性毒性，显得尤为必要。

大型溞(Daphniamagna)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳动物纲(Crustacea)，在世界范围分布广泛，处在水生生态系统食物链的第二级(初级消费者)，具有重要的生态学地位。大型溞体形小、易于实验室操作和繁殖、全年可获得幼溞，主要以孤雌生殖方式进行繁殖，易于得到基因型一致的单克隆个体，对有毒物质敏感性高，被作为标准测试生物广泛应用于有毒物质的急性和慢性毒性研究[16]，获得的毒性数据是我国新化学物质管理常规登记中必须提供的毒性数据之一[17]。

防污漆活性物质的广泛使用为控制船舶和海洋设施的生物污损贡献巨大，但也导致了在世界范围内的许多港口和码头都检出了高浓度的活性物质，对生态环境和人类健康构成了潜在威胁[3]，因此，研发、筛选获得无毒或低毒、对环境友好的活性物质成为当前社会的迫切需求。笔者选用大型溞为受试生物，研究敌草隆和辣椒素对大型溞的急性和慢性毒性效应，为其环境风险评估提供基础数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

大型溞引种自沈阳化工研究院安全评价中心，在实验室用Elendt M4培养基[7,18]培养和繁殖。环境温度为(20±1) ℃，光暗比为16 h∶8 h，光照强度范围为1 000～1 500 lux，投喂浓缩的斜生栅藻液(Scenedesmusobliquus)或羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)液，使大型溞始终处于孤雌繁殖状态。实验前，大型溞已于实验室培养半年以上，验证其对重铬酸钾的24 h-EC50为1.85 mg·L-1，95%的置信限为1.72～1.99 mg·L-1，符合相关国际标准中敏感性范围(0.6～2.1 mg·L-1)[19-20]。选择出生<24 h的幼溞作为实验溞。

敌草隆购自美国Sigma公司，纯度≥98%，分子式为C9H10Cl2N2O，CAS号为330-54-1，外观为白色晶体。辣椒素购自东京化成工业株式会社，纯度>96.0%，分子式为C18H27NO3，CAS号为404-86-4，外观为白色粉末。

高分离度快速液相色谱仪(RRLC，Agilent 1260，美国)，光照培养箱(PGX-330B-22H，宁波莱福科技有限公司)，pH计(pH3210，WTW，德国)，溶解氧仪(Oxi330i和Oxi3210，WTW，德国)，水质硬度计(HI96735，HANNA，意大利)。

1.2 实验方法

1.2.1 敌草隆分析方法验证实验

为了准确表征敌草隆的实际暴露浓度，采用RRLC测定实验溶液中敌草隆浓度。建立的液相分析条件为：BDS Hypersil C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 2.4 μm)，流动相为水-乙腈(体积比为50∶50)，柱温40 ℃，检测器DAD，检测波长212 nm，流速0.4 mL·min-1，进样量3.0 μL。

标准曲线范围和检出限：准确称取敌草隆标样，用乙腈配制成251.7 mg·L-1标准贮备液。然后用50%乙腈逐步稀释，分别获得0.126、0.503、1.01、2.52、12.6和50.3 mg·L-1的标准溶液。按上述条件进行测定。以信噪比(S/N)的3倍计算检出限(LOD)，10倍计算定量限(LOQ)。

精密度分析：取2.52 mg·L-1标准溶液，连续进样6次，进行浓度测定。

回收率分析：用试验用水逐步稀释标准贮备液或标准溶液，分别获得理论浓度为1.01、1.26和2.52 mg·L-1的样品，每个样品进样测定3次，以实测浓度与理论浓度的比值计算回收率。

1.2.2 辣椒素分析方法验证实验

为了准确表征辣椒素的实际暴露浓度，采用RRLC测定实验溶液中辣椒素浓度。建立的液相分析条件为：BDS Hypersil C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 2.4 μm)，流动相为0.05%磷酸-甲醇(体积比为30∶70)，柱温40 ℃，检测器DAD，检测波长230 nm，流速0.3 mL·min-1，进样量5.0 μL。

标准曲线范围和检出限：准确称取辣椒素标样，用甲醇配制成122.5 mg·L-1标准贮备液。然后用70%甲醇逐步稀释，分别获得0.245、0.490、1.96、4.90、12.3和49.0 mg·L-1的标准溶液。按上述条件进行测定。以信噪比(S/N)的3倍计算检出限(LOD)，10倍计算定量限(LOQ)。

精密度分析：取4.90 mg·L-1标准溶液，连续进样6次，进行浓度测定。

回收率分析：用试验用水逐步稀释标准贮备液或标准溶液，分别获得理论浓度为0.490、1.23和2.45 mg·L-1的样品，每个样品进样测定3次，以实测浓度与理论浓度的比值计算回收率。

1.2.3 敌草隆和辣椒素在实验体系的溶解性和稳定性

按照经济合作与发展组织(OECD)系列指南文件No.23[21]的评估方法，通过预试验，获知敌草隆和辣椒素均较难溶于水。经过约10 min的超声波分散和约24 h的连续磁力搅拌，获得敌草隆和辣椒素在Elendt M4培养基中的饱和溶液(saturation solution, SS)，用RRLC测定其饱和溶解浓度分别为30 mg·L-1和17 mg·L-1。

敌草隆在急性和慢性毒性实验体系中的浓度在48 h内可维持在设置浓度的±20%范围内，因此，可以静态方式开展急性毒性实验，以48 h更换1次暴露溶液的半静态方式开展慢性毒性实验。可能是具有快速生物降解性的原因，辣椒素在急性毒性实验体系中的浓度半衰期约为48 h，在添加了浓缩绿藻液的慢性毒性实验体系中，浓度下降还可能会加快，因此，均以24 h更换1次暴露溶液的半静态方式开展辣椒素的急性和慢性毒性实验(表1)。

1.2.4 急性毒性实验

制备受试物的饱和溶液，再用Elendt M4培养基稀释获得不同浓度的受试物实验溶液。参照OECD 202[19]和《化学品测试方法 生物系统效应卷》[18]的方法，通过预实验，获得受试物对大型溞未产生活动抑制的最高浓度(EC0)和完全产生活动抑制的最低浓度(EC100)，从而确定正式实验的浓度范围。

对于敌草隆，以1.310为浓度间隔系数，设置10.2、13.3、17.5、22.9和30.0 mg·L-1的受试物实验组，同时设置空白对照组。对于辣椒素，以1.330为浓度间隔系数，设置32.0%、42.5%、56.5%、75.2%和100% SS的受试物实验组，同时设置空白对照组。将每个浓度实验溶液，分装入4个试验容器(150 mL烧杯)，每个容器含50 mL实验溶液和5只幼溞。环境温度控制在(20±1) ℃，光暗比为16 h∶8 h，实验持续48 h。在实验开始后24 h和48 h，观察和记录大型溞的活动抑制情况。实验期间，不曝气也不喂食。

在敌草隆的正式实验中，测定新制备的饱和溶液中敌草隆的实际浓度，再用培养基稀释获得各浓度实验溶液。实验期间不更换实验溶液，为静态实验。在0 h和48 h，测定各实验组的温度、pH和溶解氧浓度，同时采集实验溶液，用于测定敌草隆的实际浓度。

在辣椒素的正式实验中，用培养基直接稀释新制备的SS溶液，获得各浓度实验溶液。实验期间每24 h更换1次实验溶液，为24 h半静态实验。在0、24和48 h，测定各实验组的温度、pH和溶解氧浓度，同时采集新、旧实验溶液，用于测定辣椒素的实际浓度。

1.2.5 慢性毒性实验

参照OECD 211[7]和《化学品测试方法 生物系统效应卷》[18]的方法，依据大型溞急性活动抑制实验结果和预实验结果，设置正式实验的浓度范围。对于敌草隆，以1.770为浓度间隔系数，设置1.02、1.80、3.19、5.56和10.0 mg·L-1的受试物实验组，同时设置空白对照组；对于辣椒素，以1.351为浓度间隔系数，设置15%、20.3%、27.4%、37%和50% SS的受试物实验组，同时设置空白对照组。每个实验组设置10个平行(容器)，每个容器(150 mL烧杯)含80 mL实验溶液和1只亲溞。环境温度控制在(20±1) ℃，光暗比为16 h∶8 h，光照强度范围为1 000～1 500 lux，实验周期为21 d。实验期间，不曝气，每天向各个容器投喂藻细胞浓缩液，投喂量(以碳计)为0.1～0.2 mg C·溞-1·d-1。

在敌草隆的正式实验中，每天投喂浓缩的斜生栅藻液，每48 h更换1次实验溶液，测定每个实验组在0、8和18 d的新实验溶液和2、10和20 d的旧实验溶液中敌草隆的实际浓度，测定空白对照组和1.02、10.0 mg·L-1的实验组在0、8和18 d的新实验溶液和2、10和20 d的旧实验溶液中的温度、pH、溶解氧浓度和总硬度。

表1 敌草隆和辣椒素在急性和慢性实验体系中的稳定性Table 1 Stability of diuron and capsaicin in test system of acute and chronic test

在辣椒素的正式实验中，每天投喂浓缩的羊角月牙藻液，每24 h更换1次实验溶液，测定每个实验组在实验开始时、每次更换实验溶液前后和实验结束时实验溶液中辣椒素的实际浓度，测定空白对照组和5% SS、50% SS的实验组在0、8和15 d的新实验溶液和1、9和16 d的旧实验溶液中的温度、pH、溶解氧浓度和总硬度。

试验期间，每天观察亲溞的外观和存活情况，及时移除出生的幼溞并计算存活幼溞的数量，记录亲溞的死亡率、产幼溞的数量、初次生殖时间和总生殖胎数。试验结束时，测定所有存活亲溞的体长。

1.3 数据统计与分析

用Office Excel 2010汇总和整理数据。

对大型溞急性毒性效应数据，用概率分析法(Probit Analysis Method)和修正的斯皮尔曼-卡伯法(Trimmed Spearman-Karber Method)统计EC50。

对大型溞慢性毒性效应数据，先进行正态分布检验(Shapiro-Wilk test检验)、方差齐性检验(Levene’s test检验)。在数据符合正态分布且等方差性前提条件下，使用方差分析检验显著性差异，并用多重比较检验(Dunnet’t test)分析处理不同浓度间的差异显著性。若数据不符合正态分布或存在不等方差性时，采用非参数检验(Kruskal-Wallis test)分析其显著性差异。所有数据统计分析均在SPSS 22.0统计分析软件上进行。

2 结果(Results)

2.1 敌草隆和辣椒素分析方法验证结果

以吸收峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)，进行线性回归分析，结果如图1所示。敌草隆在0.126～50.3 mg·L-1的浓度范围内与峰面积积分值存在极好的线性关系，线性方程为y= 53.6x+ 7.5998 (R2= 0.9998)，LOD为0.0330 mg·L-1，LOQ为0.110 mg·L-1。辣椒素在0.245～49.0 mg·L-1的浓度范围内与峰面积积分值的线性关系极好，线性方程为y= 22.8x+ 1.8293 (R2= 0.9999)，LOD为0.0665 mg·L-1，LOQ为0.222 mg·L-1。

精密度分析结果表明，2.52 mg·L-1的敌草隆标准溶液，连续进样6次测得的平均峰面积为140.42，相对标准偏差(RSD)为0.23%；4.90 mg·L-1的辣椒素标准溶液，连续进样6次测得的平均峰面积为116.69，RSD为0.34%，说明2个分析方法的精密度良好。

回收率分析结果表明，加标1.01、1.26和2.52 mg·L-1的敌草隆样品的平均回收率分别为92.2%、96.2%和102%；加标0.490、1.23和2.45 mg·L-1的辣椒素样品的平均回收率分别为89.2%、92.9%和97.3%，说明2个分析方法的回收率良好(表2)。

表2 敌草隆和辣椒素回收率实验结果Table 2 Results of recovery test for diuron and capsaicin

2.2 敌草隆和辣椒素在实验体系的稳定性和暴露浓度的表征

正式实验中，敌草隆的实测浓度在48 h内能始终维持在设置浓度的±20%范围内，与预实验的情况一致，可直接以设置浓度表示敌草隆的暴露浓度。

由于辣椒素具有快速生物降解性，在其慢性毒性正式实验中，可能是加入浓缩的藻液加速了其降解，在24 h内其部分实测浓度低于初始浓度的80%，因此，需以实测浓度的时间-加权平均值表示其暴露浓度[21]。急性毒性正式实验中，32.0%、42.5%、56.5%、75.2%和100% SS实验组的时间-加权平均值分别为4.52、6.01、8.08、10.9和14.6 mg·L-1；慢性毒性正式实验中，15%、20.3%、27.4%、37%和50% SS实验组的时间-加权平均值分别为1.95、2.65、4.33、5.83和8.06 mg·L-1。

图1 敌草隆和辣椒素的分析标准曲线Fig. 1 Standard curve for analysis of diuron and capsaicin

2.3 对大型溞的急性毒性

急性毒性实验中，溶液的pH在7.62～8.22范围内，溶解氧浓度在4.7～8.3 mg·L-1之间，始终满足不低于3 mg·L-1的实验有效性要求。2组实验的空白对照组大型溞表观均正常，无活动抑制和死亡现象。大型溞暴露于不同浓度的实验溶液后，随着时间的延长，在不同浓度组中表现出不同程度的活动抑制，浓度-效应相关性显著。

敌草隆对大型溞的24 h和48 h EC50分别为>30 mg·L-1和17.1 mg·L-1；辣椒素对大型溞的24 h和48 h EC50分别为13.3 mg·L-1和12.4 mg·L-1，如表3所示。可见，大型溞对辣椒素的毒性响应较快，但到48 h时，两者所呈现的急性毒性水平相当。根据《化学品分类和标签规范 第28部分：对水生环境的危害》(GB 30000.28—2013)[8]的急性分类标准，敌草隆和辣椒素对大型溞都属于急性水生危害的类别3。

表3 敌草隆和辣椒素对大型溞急性毒性效应Table 3 Acute toxicity of diuron and capsaicin to Daphnia magna

2.4 对大型溞的慢性毒性

敌草隆和辣椒素的慢性毒性实验中，空白对照组亲溞的死亡率均为0%，所产存活幼溞数量的平均数和标准差分别为179±7(变异系数为3.9%)和158±14(变异系数为8.3%)，均>60，满足OECD 211对实验有效性的要求，变异系数均<25%，表明实验运行的质量良好。实验溶液的pH在7.80～8.81范围内，溶解氧浓度在7.5～9.1 mg·L-1范围内，水温在19. 5～20.8 ℃之间，水质总硬度为260～270 mg·L-1(以CaCO3计)，光照强度范围在1 010～1 375 lux。

2.4.1 敌草隆的慢性毒性

各项毒性指标结果如表4所示。1.02、1.80、3.19、5.65和10.0 mg·L-1实验组的亲溞死亡率分别为0%、0%、0%、0%和20%，经Cochran-Armitage趋势检验，显示浓度与亲溞死亡率之间有紧密的相关性，表明敌草隆具有一定的慢性致死效应。

表4 敌草隆对大型溞慢性毒性实验各项毒性指标结果汇总Table 4 Summary of all endpoints observed in the chronic test of diuron to Daphnia magna

敌草隆对大型溞的初次生殖时间、总生殖胎数、体长和产存活幼溞数量都存在不同程度的毒性效应。与空白对照组相比，1.80、5.65和10.0 mg·L-1实验组能显著延迟(P<0.05)大型溞的初次生殖时间，LOEC为1.80 mg·L-1，NOEC为1.02 mg·L-1；10.0 mg·L-1实验组亲溞始终未产幼溞，数量为0(P<0.05)，LOEC为10.0 mg·L-1，NOEC为5.65 mg·L-1；5.65 mg·L-1和10.0 mg·L-1实验组存活亲溞的体长显著缩短(P<0.05)，LOEC为5.65 mg·L-1，NOEC为3.19 mg·L-1；所有浓度实验组所产存活幼溞的数量均显著性减少(P<0.05)，NOEC为<1.02 mg·L-1。

产幼溞数量的减少是所有毒性效应中最敏感的指标。以大型溞繁殖抑制率计算EC10为0.830 mg·L-1，95%置信区间为0.696～5.67 mg·L-1；EC50为7.52 mg·L-1，95%置信区间为7.45～7.59 mg·L-1。

2.4.2 辣椒素的慢性毒性

各项毒性指标结果如表5所示。1.95、2.65、4.33、5.83和8.06 mg·L-1实验组的亲溞死亡率分别为0%、0%、10%、10%和30%，经Cochran-Armitage趋势检验，显示浓度与亲溞死亡率之间有紧密的相关性，表明辣椒素具有一定的慢性致死效应。

表5 辣椒素对大型溞慢性毒性实验各项毒性指标结果汇总Table 5 Summary of all endpoints observed in the chronic test of capsaicin to Daphnia magna

辣椒素对大型溞的初次生殖时间、总生殖胎数、体长和产存活幼溞数量都存在不同程度的毒性效应。与空白对照组相比，8.06 mg·L-1实验组能显著延迟(P<0.05)大型溞的初次生殖时间，LOEC为8.06 mg·L-1，NOEC为5.83 mg·L-1；5.83 mg·L-1和8.06 mg·L-1实验组亲溞的总生殖胎数会显著减少(P<0.05)，LOEC为5.83 mg·L-1，NOEC为4.33 mg·L-1；4.33、5.83和8.06 mg·L-1实验组存活亲溞的体长会显著缩短(P<0.05)，LOEC为4.33 mg·L-1，NOEC为2.65 mg·L-1；所有浓度实验组所产存活幼溞的数量均显著性减少(P<0.05)，NOEC为<1.95 mg·L-1。

产幼溞数量的减少是所有毒性效应中最敏感的指标。以大型溞繁殖抑制率计算EC10为1.63 mg·L-1，95%置信区间为1.10～2.22 mg·L-1；EC50为5.31 mg·L-1，95%置信区间为4.74～5.74 mg·L-1。

3 讨论(Discussion)

敌草隆和辣椒素对大型溞急性活动抑制的48 h-EC50分别为17.1 mg·L-1和12.4 mg·L-1，对溞类毒性都属于急性类别3[8]。根据Wang等[9]的研究，可知辣椒素对羊角月牙藻的EC50为5.114 mg·L-1，对斑马鱼LC50为5.98 mg·L-1，说明在藻、溞和鱼3个营养水平的生物中，藻类和鱼类对辣椒素的急性毒性更为敏感。有文献报道，敌草隆对月牙藻的96 h-IC50为10.4 μg·L-1[5]，对近具刺链带藻的72 h-IC50为46.3 μg·L-1[6]，对蚤状溞繁殖抑制的7 d-LOEC为7.7 mg·L-1，NOEC为4.0 mg·L-1[4]，对黑头呆鱼幼鱼的10 d-LC50为27.1 mg·L-1[4]，显示在3个营养水平中，藻类是对敌草隆最为敏感的物种，与刘亚楠等[1]得出的结论一致。

大型溞慢性毒性指标对敌草隆和辣椒素的敏感性不完全一致。对于敌草隆，各指标敏感性强弱依次为：幼溞数量>初次生殖时间>体长>总生殖胎数；对于辣椒素，各指标敏感性强弱依次为：幼溞数量>体长>总生殖胎数>初次生殖时间；可见，在所有毒性指标中产幼溞数量始终是最敏感的毒性指标。蔡小宇等[22]研究壬基酚聚氧乙烯醚对大型溞的慢性毒性时，发现总生殖胎数是最敏感的毒性指标；李娜等[23]研究多氯联苯(PCB28)对大型溞的慢性毒性时，发现第一次产卵时间最为敏感。这可能是由于不同化学物质在生物体内的代谢途径不同，从而导致毒性的症状表现不同。

本研究中，敌草隆对大型溞繁殖抑制的21 d-NOEC<1.02 mg·L-1，低于Nebeker和Schuytema[4]研究得出的对蚤状溞的7 d-NOEC(4.0 mg·L-1)，表明敌草隆在低浓度下长期暴露，仍会对水生生物造成危害。Mansano等[24]在研究敌草隆对新热带区溞类(Ceriodaphniasilvestrii)的慢性毒性中，发现低浓度(250～2 000 μg·L-1)敌草隆能刺激溞类繁殖，当浓度达到6 000 μg·L-1时才会显著地(P<0.05)抑制繁殖，抑制繁殖的8 d-NOEC为4 000 μg·L-1，8 d-LOEC为6 000 μg·L-1，这与本研究结果有较大的差异，可能是暴露时间不同或物种差异造成的。ECx是根据在暴露时间内的浓度-效应曲线，经过统计计算获得的引起x%受试生物产生毒性响应的毒物浓度；而NOEC则是假定存在的一个浓度(或剂量)阈值，毒物低于此阈值即观察不到显著毒性效应，但是并非所有化学物质的所有毒性终点都存在上述阈值[25]，且不同实验浓度设置获得的该阈值存在差异。近年来，随着科学技术的发展，许多研究者主张用ECx(如EC10)替代NOEC，用于化学物质的环境风险评估[8,26]。本研究中，基于所产存活幼溞的数量，计算敌草隆对大型溞繁殖抑制的21 d-EC10为0.830 mg·L-1，辣椒素对大型溞繁殖抑制的21 d-EC10为1.63 mg·L-1。根据《化学品分类和标签规范 第28部分：对水生环境的危害》(GB 30000.28—2013)对慢性毒性的分类标准，同时考虑到敌草隆在环境中具有持久性，认为敌草隆具有长期的水生危害，属于慢性类别2；而对于辣椒素，由于其具有快速生物降解性，可判定其没有长期水生危害，体现了环境友好性，与Wang等[9]和Oliveira等[15]得出的辣椒素生态风险评估结论一致。

OECD 211推荐作为大型溞食物的藻种为小球藻(Chlorellasp.)、羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)和近具刺链带藻(Desmodesmussubspicatus)。本研究中，敌草隆的慢性毒性实验中以斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)为食物，不属于推荐藻种种类，但也能满足大型溞生长和繁殖的营养需求，空白对照组亲溞产存活幼溞数量的平均数和标准差为179±7，与熊勤犁等[27]研究中的161±19相近，均能满足试验有效的要求。