不同蛋白酶对豆粕抗原蛋白降解程度的比较分析

张忠鑫 邹球龙 黎 琪 张晓琳 仉 磊*

（1.中粮营养健康研究院有限公司，北京102209；2.北京市畜产品质量安全源头控制工程技术研究中心，北京102209）

豆粕作为优质的植物性蛋白质，是目前饲料工业应用最广泛的原料之一。豆粕的氨基酸组成较为合理，可满足动物营养需要，但存在抗营养因子种类多、含量高的缺陷，使得其作为动物饲料的消化利用率偏低，造成浪费的同时也引起腹泻等诸多的动物疾病[1-4]。其中大豆球蛋白（Glycinin）和β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）这两种抗原蛋白致敏性最强，占大豆总蛋白的65%以上[4]。因此，如何降低饲料的抗原蛋白从而提升豆粕利用价值是饲料企业和养殖者亟需解决的问题。

抗原蛋白可以通过微生物发酵及利用蛋白酶酶解进行消除。实际生产中往往两者同时进行[5-12]。蛋白酶制剂主要根据其最适pH值分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶及碱性蛋白酶[13]。尽管豆粕的pH值在6.4～6.8的近中性范围，但在微生物发酵过程中发酵豆粕的pH值逐渐降至4.5～5之间。另外在微生物发酵过程中的体系温度也与酶制剂的最适温度有差异。因此，选用适于微生物发酵条件的酸性蛋白酶及中性蛋白酶，并调节二者的剂量比例对提升发酵豆粕的抗营养因子降解效率十分重要。本研究通过调研部分市售蛋白酶产品，检测其在微生物发酵条件下对豆粕抗原蛋白的降解能力，为工业生产过程中挑选适合的发酵剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

46%豆粕购自三河汇福粮油集团饲料蛋白有限公司；MRS 培养基及LB 培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；大豆球蛋白定量测定试剂盒购自北京龙科方舟生物工程技术有限公司；其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，植物乳杆菌GJ25 及枯草芽孢杆菌BS01均为实验室保藏菌株。

通过市场调研，分别采购12 种市售酸性及中性蛋白酶，厂家信息略。

1.2 试验方法

1.2.1 检测酸性蛋白酶降解豆粕抗原蛋白

根据市售发酵豆粕产品的实际情况，在利用酸性蛋白酶降解抗原蛋白时，体系中添加2%的乳酸。即分别在200 ml 无菌水中加入称取的0.2 g 酶制剂（50 000 U/g）及2 g 乳酸，混匀后加入到100 g 豆粕中，搅拌均匀后置于37 ℃恒温24 h，酶解完成后按王寅等[14]报道的方法提取蛋白质，选用12%分离胶进行SDS-PAGE检测，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量变化[14-16]。

1.2.2 检测中性蛋白酶降解豆粕抗原蛋白

由于豆粕的pH值为6.5左右，因此无额外条件更改。即分别在200 ml无菌水中加入称取的0.2 g酶制剂（50 000 U/g），混匀后加入到100 g 豆粕中，搅拌均匀后置于37 ℃恒温24 h，发酵完成后提取蛋白质[14]，选用12%分离胶进行SDS-PAGE检测，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量变化[14-16]。

1.2.3 蛋白酶解与微生物发酵同时进行的情况分析

接种GJ25乳酸菌种子于MRS 培养基，37 ℃过夜静置培养，使其活菌数达到1×109CFU/ml 以上；接种BS01枯草芽孢杆菌种子于LB培养基，37 ℃过夜振荡培养，使其活菌数达到1×106CFU/ml以上。以上两类菌液各取1 ml 加入到200 ml 无菌水中，按试验比例（酸性蛋白酶与中性蛋白酶的比例为10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10）称取不同质量的两类蛋白酶并接入水中，保证两种蛋白酶酶活总值为50 000 U/g，称取混合酶制剂的质量为0.4 g。充分混合后加入到100 g豆粕中，搅拌均匀后置于37 ℃恒温48 h，发酵完成后提取蛋白质[14]，选用12%分离胶进行SDS-PAGE检测，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量变化[14-16]，从而选出最优酶制剂比例。

1.2.4 发酵时间的确定

按照所选择的酶制剂比例重复进行1.2.3节的试验，并在0、1、3、16、24、48、72 h取样并提取蛋白质[14]，进行电泳检测并利用胶图分析软件UVP-VisionWorks对电泳结果中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的条带进行定量分析：将未经处理的豆粕对照样品中的对应条带设定为100%，计算其他各试验组相关条带的相对含量，从而挑选出最合适的发酵时长。

1.2.5 乳酸含量测定

取10 g 样品，加入100 ml 煮沸过的去离子水，振荡溶解10～20 min，取样离心取上清，利用生物传感分析仪（型号SBA-40E，山东省科学院生物研究所）测定乳酸含量并换算样品中乳酸含量。

1.2.6 大豆球蛋白含量测定

利用大豆球蛋白定量测定试剂盒（北京龙科方舟生物工程技术有限公司）进行测定。

1.2.7 粗蛋白含量测定依据国家标准《饲料中粗蛋白的测定，凯氏定氮法》（GB/T 6432—2018）进行测定。

1.2.8 酸溶蛋白含量测定

按照常磊等[11]报道的方法进行测定。

2 试验结果

2.1 不同酸性蛋白酶对豆粕中抗原蛋白降解效果的比较

利用不同酸性蛋白酶对豆粕进行处理，通过对其产物进行蛋白质电泳检测各酸性蛋白酶对豆粕中两类抗原蛋白的降解效果，结果如图1所示，在实验设定条件下(试验方法1.2.1)，各酸性蛋白酶酶制剂对豆粕的抗原蛋白降解程度具有差异，5号酸性蛋白酶在此条件下对抗原蛋白降解效率较高，其工作浓度为0.2%(m/m)。

图1 不同酸性蛋白酶制剂对豆粕抗原蛋白的降解效果

2.2 不同中性蛋白酶对豆粕中抗原蛋白降解效果的比较

利用不同中性蛋白酶对豆粕进行处理，通过对其产物进行蛋白质电泳检测各中性蛋白酶对豆粕中两类抗原蛋白的降解效果，结果如图2所示，在实验设定条件下(试验方法1.2.2)，各中性蛋白酶酶制剂对豆粕的抗原蛋白降解程度具有差异，5号中性蛋白酶在此条件下对抗原蛋白降解效率较高，其工作浓度为0.2%(m/m)。

2.3 不同蛋白酶配比剂量对豆粕抗原蛋白降解程度的比较

将上文挑选出的两种蛋白酶按照如图3 所示的质量比例进行混合，在微生物存在条件下（试验方法1.2.3，GJ25 及BS01 在达到菌液浓度要求后,每100 g豆粕添加1 ml菌液）发酵48 h后提取蛋白质进行电泳检测，结果如图3。

图2 不同中性蛋白酶制剂对豆粕抗原蛋白的降解效果

图3 两类蛋白酶不同比例条件下的菌酶协同效果

通过胶图分析软件UVP-VisionWorks对图3(a)中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的条带进行定量分析，并将未经处理的豆粕对照样品中的对应条带设定为100%，计算其他各试验组相关条带的相对含量，得到图3(b)的结果。结果显示，酸性蛋白酶与中性蛋白酶的混合作用可降解豆粕中大于60%的两类抗营养因子。其中，酸性蛋白酶与中性蛋白酶的比例在1∶1至1∶5内降解效果达到最优，最终确定比例为1∶1时较为合理，两者工作浓度均为0.2%。

2.4 发酵时间的确定

利用5 号酸性蛋白酶与5 号中性蛋白酶1∶1 配比的酶制剂，在微生物存在条件下（试验方法1.2.4）对豆粕进行处理，在72 h内不同时间点采集样品并进行对应的电泳检测，结果如图4。

图4 发酵时间对豆粕发酵效果的影响

图4可见，豆粕中两种抗营养因子的降解效果随时间增长而提高，在48 h时达到最高，与72 h发酵效果无明显差异，因此选定利用上文所述两种酶制剂1∶1配比的菌酶协同发酵时间为48 h。

2.5 发酵效果评价

依据上述结果，参考本试验所用条件（试验方法1.2.3 及1.2.4）最终确定了发酵条件为：5 号酸性蛋白酶0.2%，5号中性蛋白酶0.2%，1%（v/m）枯草芽孢杆菌BS01（菌液浓度为1×106CFU/ml），1%（v/m）植物乳杆菌GJ25（菌液浓度为1×109CFU/ml），发酵时间48 h。对在该条件下得到的发酵豆粕进行部分指标测定，结果如表1所示。

表1结果表明，本文确定的发酵剂及发酵条件下，发酵豆粕的粗蛋白及其中酸溶蛋白含量较高，提示其营养价值高。大豆球蛋白含量较低，提示该产品对豆粕中抗营养因子降解效果较好。产品pH值较低，乳酸含量较高可帮助维持动物肠道环境。另外，该产品还对水苏糖和棉籽糖两类抗营养因子降解效果明显。

表1 豆粕发酵前后指标检测（以干物质88%计）

3 讨论

发酵豆粕是解决豆粕在动物饲喂过程中消化利用率低下的重要手段之一，生产发酵豆粕需要根据原料特点选择适合的条件及发酵剂。目前发酵豆粕生产所采用的发酵剂包含酶制剂和微生物。其中针对蛋白质降解起主要作用的是蛋白酶制剂[9-10]。目前市场上酶制剂种类繁多，但是大部分酶制剂的最适条件与实际生产条件存在差异。在对酶制剂进行选择的时候不能仅凭酶活力大小作为判断依据，而应重点关注针对目标底物的特异性效果。

本试验针对降解豆粕中主要的抗营养因子大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白这一目的，从挑选在非最适条件下适于降解豆粕的酶制剂入手，通过调整菌剂及酶制剂的配比，实现了较小成本下生产具有较高品质的发酵豆粕。依据蛋白酶制剂的国家标准（GB/T 23527—2009），固体蛋白酶产品的活力单位定义为：1 g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸，即为一个酶活力单位，以U/g 表示[13]。在发酵豆粕生产过程中，为保证益生菌的增殖及活性，其发酵过程中的温度变化及pH 值变化很难保证蛋白酶处在其最适条件。因此酶制剂产品所标示的酶制剂活力并不能反映出其对不同底物如豆粕中大豆蛋白的降解程度。本研究结果表明，不同来源的酶制剂在酪蛋白水解能力一致的条件下，针对特定原料豆粕的降解效果存在差异。同时中性蛋白酶对豆粕的降解起到更主要的作用，这一结果也同前人研究结果一致，综合考虑成本因素和豆粕降解效果，本研究最终确定了上述酶制剂配比比例及发酵条件。需要说明的是，由于是随机盲选，酸性蛋白酶和中性蛋白酶的最优组编号均为5号，但是两者并不来自同一厂家。另外，本试验所用豆粕均为自然颗粒大小，没有经过粉碎处理，也没有灭菌处理，这些条件也是考虑到目前大部分发酵豆粕生产厂家的实际情况，尽量简化发酵的条件控制，具体发酵条件在实际生产中也可根据实际情况进行微调。同时，本研究针对特定原料进行酶制剂筛选的思路和方法，也为实际生产中如何选择合适的发酵剂产品提供了新的参考方案。

4 结论

本研究通过对酶制剂及酶制剂配比进行筛选，确定了菌酶协同发酵中一套最适的发酵条件，适合发酵豆粕生产。得到的发酵豆粕产品中，粗蛋白含量50.86%，酸溶蛋白14.76%，大豆球蛋白25.3 mg/g，pH 值4.5，乳酸含量2.76%，水苏糖含量0.017%，棉籽糖含量0.082%。该产品抗营养因子低、乳酸含量高，是有益动物肠道健康的发酵豆粕产品，并能较大程度节约成本。