基于激光拉曼光谱的石斛黄酒酒精快速检测方法研究

张仲义

（皖西学院电信学院 安徽六安 237012）

一、引言

石斛黄酒因其具有丰富的营养价值与保健功能备受人们的关注，主要是因为石斛含有功能性多糖与微量元素[1]。为了提升石斛黄酒的营养价值与质量，广大科研工作者一直致力于生产工艺方面的研究。曾丽萍等人通过正交试验方法优化芽孢杆菌与酿酒酵母发酵石斛酒条件，研制出口感达到97.5分的石斛酒[2]。然而，酒精是反映黄酒发酵程度与质量的重要指标之一。赵梅等人发现黄酒前后发酵期酒精的浓度与氨基酸、总糖具有明显的线性关系[3]。因此，黄酒厂家一般会通过监测黄酒的酒精浓度来判断酒糟的发酵程度。Yu等人通过红外光谱快速进行测定黄酒中酒精浓度，并建立了酒精与黄酒品质匹配的参数模型[4]。但是，由于红外光谱检测方法制样比较复杂，容易受水吸收峰的干扰，无法满足黄酒发酵过程快速检测需求。

激光拉曼光谱是近些来用于复杂样品无损分析的重要手段之一，能够替代红外光谱进行水样微量分析。刘文涵等人建立了白酒类乙醇检测的激光拉曼光谱法，检出限达到1.02%[5]。然而，对于黄酒类复杂产品的拉曼光谱检测方法鲜有报导。本文通过以拉曼位移880cm-1（-CCO伸缩振动）和1455cm-1（-CH2弯曲振动）作为特征峰，建立了检测乙醇溶液浓度的激光拉曼光谱指纹图谱。同时，以不同发酵程度的石斛黄酒为研究对象进行检测与验证，为推动速效监控黄酒质量技术提供重要的参考依据。

二、材料与方法

（一）仪器试剂。分析天平（BD61型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；微量分析型超纯水机（ULUP-I型，四川优普超纯科技有限公司）；台式高速离心机（SIGMA1-14型，德国Sigma公司）；不锈钢发酵罐（HF-S型，北京霍尔斯生物科技有限公司）；激光拉曼光谱仪（LRS2/3型，天津港东科技发展股份有限公司）：激发光源532nm，40mW；光栅1200L/mm；狭缝宽度0-2mm；示值精度0.01mm；物镜倍数为50倍。

无水乙醇（AR，≥99.7%）购于国药集团化学试剂有限公司；石斛及其它辅料购于本地超市；实验所用水均为超纯水。

（二）实验方法。

1.乙醇标准液的测定。准确量取1、2、5、10、20mL乙醇，分别配置成浓度为1%、2%、5%、10%、20%乙醇溶液。分别移取各个浓度的乙醇溶液20μL，滴到拉曼光谱仪载玻片上，并使用激光拉曼光谱仪自带的物镜进行观察，对焦进行光谱扫描测定。

2.石斛黄酒发酵试验。称取适量糯米，淘洗干净后冷水浸泡12h，沥干蒸煮至熟，冷却后准确称量1000g米饭移入发酵罐中，加入铁皮石斛、活化后液态酵母、麦曲以及适量的水，混合均匀，控制温度15-18℃，密封发酵20天。为了保证实验的准确性设置3组平行试验。

3.样品采集。根据黄酒酿造经验，其主发酵时间主要在5-7天，后发酵时间主要指10-20天。因此，为了让取样点分布均匀同时不影响发酵质量，样品采集时间点分别设置为第2、5、7、15、20天。每组平行试验各采集1个样，合计15个样品。收集到的样品在4000r/min下离心5min，取上清液过滤，滴到拉曼光谱仪载玻片上，并使用激光拉曼光谱仪自带的物镜进行观察，对焦进行光谱扫描测定。

4.数据采集与处理。本文使用origin 8.0对实验数据进行统计与作图，并使用软件数据分析模块进行均值化与标准差分析。

三、结果与讨论

（一）不同浓度乙醇拉曼光谱。如图1所示，分别为浓度1%、2%、5%、10%、20%乙醇溶液拉曼光谱图。大部分特征峰主要集中在750cm-1-3000cm-1拉曼位移区域，其它区域拉曼峰主要是水溶剂背景的特征峰，例如拉曼位移3200cm-1附近的特征峰。其中拉曼位移880cm-1处最为明显，主要是因为乙醇分子中的-CCO伸缩振动。此外，乙醇的拉曼光谱特征峰还包括拉曼位移 1085cm-1、1455cm-1、2880cm-1以及2935cm-1处。尽管这些特征峰与前人研究的谱图存在少许偏差，但基本保持在±2cm-1左右。其中，拉曼位移1085cm-1处为-CH3不对称伸缩振动；拉曼位移1455cm-1和2880cm-1处为-CH2-与-CH3不对称变形（弯曲）振动；拉曼位移2935cm-1处为-CH2-与-CH3不对称伸缩振动。

图1 不同浓度乙醇溶液拉曼谱图

（a-e乙醇浓度：1%、2%、5%、10%、20%）

此外，考虑到溶剂背景以及样品其它干扰组分的存在，本文选择峰强度最高的拉曼位移880cm-1处作为定量峰。随着乙醇浓度不断增大，定量特征峰强度呈线性增大，所以拉曼位移880cm-1处特征峰强度能够用于测定乙醇的含量。如表1所示，为定量峰峰强度与乙醇浓度数据汇总，通过origin软件方差分析计算，得到乙醇浓度与拉曼位移880cm-1处特征峰强度相关系数r2=0.9915，线性回归方程：Y=59.731x+26.048。通过回归方程计算，加标后乙醇溶液回收率达到85.2%～108.6%。

表1 定量峰峰强度与乙醇浓度数据

（二）加标样品拉曼光谱。根据设定的取样规则，分别在第2、5、7、15、20天取样并使用激光拉曼光谱检测。如图2所示，充分体现了石斛黄酒发酵制备不同阶段乙醇浓度与时间变化的关系。在发酵过程中，在活性酵母与麦曲的催化作用下，糯米、石斛等碳水化合物不断的转化为乙醇。其中第0～7天为主发酵期，乙醇的浓度急剧增加，在第7天乙醇含量达到95g/L；在第7～20天为次发酵期，乙醇转化的速度逐渐下降，最终含量逐渐趋于恒定（大约为110g/L）。

同时，不同发酵时间样品的拉曼光谱图显示，随着发酵时间的增加乙醇的拉曼光谱特征峰：拉曼位移880cm-1、1085cm-1、1455cm-1、2880cm-1以及 2935cm-1处的峰强度均逐渐增大，说明乙醇产量在不断增加。在主发酵期，拉曼位移1000cm-1-2000cm-1处存在较多干扰峰，可能由于主发酵过程中多糖、有机酸、淀粉等成分的影响导致出现峰强较弱的杂乱峰。但拉曼位移880cm-1处特征峰依然比较突出，不影响乙醇浓度的检测。而在次发酵期，第10天与第20天的拉曼光谱谱图中的特征峰型与数量基本一致，说明第10天基料碳水化合物以及基本全部转化为乙醇，其他组分对于谱图的干扰较小。

图2 不同发酵时间样品乙醇浓度变化

四、结论

随着网络科技的发展，促进了石斛黄酒产业的迅速复苏与突破地域的局限性，加快我国功能性饮品行业的改革速度。但黄酒产品质量分析与监控技术的研究依旧是目前的大热点。为遏制市场上售卖虚假石斛黄酒的现象，提升黄酒产品质量监控检测技术，本文通过激光拉曼光谱技术建立快速检测石斛黄酒生产过程中乙醇浓度的方法。不仅具有分析速度快、准确度高、回收率好等优点，还实现了无损、绿色的乙醇浓度定性、定量检测，对石斛黄酒实际生产过程质量监测具有良好的应用价值。