长链非编码RNA LINC01133通过上皮-间充质转化途径促进喉鳞癌进展的机制研究

曹 欢，池伟伟，桑吕萍，赵 雷，于苗苗，王宝山

(1.河北医科大学第二医院耳鼻咽喉科，河北 石家庄 050011 2.河北医科大学第一医院耳鼻咽喉科，河北 石家庄 050031 3.河北大学附属医院耳鼻咽喉科，河北 保 定 071000)

喉鳞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是耳鼻喉-头颈外科及肿瘤外科常见的一种恶性实体肿瘤。随着相关研究的逐步开展，有关LSCC的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)作用机制研究有了一定的认识，但鉴于复杂多样的lncRNA调控机制来说，进一步探讨其作用机制尤为必要[1]。既往研究报道，长链非编码RNA LINC01133在胰腺肿瘤、肝细胞癌等多种肿瘤中高表达，并能促进肿瘤进展[2,3]，但目前尚未发现其在LSCC中的相关研究。本研究对LINC01133在LSCC中的表达临床意义及功能进行了深入探讨。

1 资料与方法

1.1细胞系来源:由河北医科大学耳鼻咽喉头颈外科生物样本库留存并传代培养的4株LSCC细胞系(TU212、TU686、TU177、AMC-HN-8)。

1.2组织样本来源:LSCC癌与癌旁组织样本均取自于2016年10月至2019年4月接受手术的LSCC患者，由河北医科大学耳鼻咽喉头颈外科生物样本库负责收集并储存，所有患者均已签署书面同意。本实验获得河北医科大学伦理委员会及河北医科大学第二医院伦理委员会批准。

1.3临床资料:该研究纳入48例LSCC患者组织样本，其中男性47例，女性1例，年龄44～77岁，中位年龄59岁，见表1。其中59岁(中位年龄)作为年龄的分组标准，TNM分期参照LSCC国际抗癌协会(UICC 2012)分期标准，见表1。

表1 LSCC患者临床参数

1.4总RNA提取及cDNA合成：实验中所涉及细胞系、组织样本总RNA提取及cDNA合成，均参照课题组前期研究[1]。

1.5LINC01133相对表达水平检测：LINC01133相对表达水平检测及计算方法均参照课题组前期研究[1]。相关引物如下，LINC01133上游5’-GTACCAAGGTGTGCTGAAG-3’，下游5’- GCATAGACTTGAGGTTCCATT-3’，产物125bp，GAPDH引物参照前期研究[1]。

1.6特异性shRNA载体构建及转染：针对LINC01133的特异性shRNA载体设计及合成，由上海吉玛公司完成。序列如下，sh1-LINC01133-GTGCCTCTGAGTTTGTTTACT；sh2-LINC01133-CCTTATTCTTTATGAGGCACT；sh3-LINC01133-CGGGAAGATTTCCTAATCTCA；sh4-LINC01133-CTTGAAGTTACCTGAGAATGG；shGAPDH-GTATGAACAACAGCCTCAAG；shNC-GTTCTCCGAACGTGTCACGT。转染参照Lipofectamine®2000(Invitrogen，USA)说明书操作步骤完成。转染后常规培养24h，通过倒置荧光显微镜(OLYMPUS，Japan)观察转染效率，并提取各组细胞系总RNA，检测各shRNA转染前后细胞中LINC01133表达改变情况，评估各shRNA干扰效率，并选择干扰效率明显的shRNA-LINC01133用于后续功能试验。

1.7过表达载体构建及转染：LINC01133过表达质粒(LINC01133-pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(-))由生工生物工程(上海)股份有限公司负责设计并制备。通过Lipofectamine®2000(Invitrogen，USA)转染试剂，按相关说明书操作步骤完成各组质粒的细胞内转染。转染后继续常规培养24h，分别提取各组细胞系总RNA，并通过qRT-PCR的方法，检测表达载体转染前后，细胞中LINC01133相对表达水平的改变趋势，评估表达载体的转染效率，并选择过表达效果明显的载体用于后续功能试验。

1.8CCK-8实验：各组生长状态良好的细胞系，分别制备呈单个细胞悬液，并计数细胞浓度，按每孔100ul(2000个细胞)细胞悬液接种于96孔板，每孔4个重复，接种后常规培养至细胞贴壁后开始检测，分别于0、24、48、72、96h每孔加入10ul CCK-8试剂(MCE，China)，孵育3h后通过Spark®多功能酶标仪(TECAN，Switzerland)检测450nm吸光度值。实验重复3次。

1.9克隆形成实验：各组生长状态良好的细胞系，分别制备呈单个细胞悬液，并计数细胞浓度，按每孔2ml(含2000个细胞)细胞悬液接种于6孔板，每孔设置3个重复，常规培养10d，PBS溶液清洗3遍、多聚甲醛(4%)固定并晾干、结晶紫溶液(0.5%)染色，镜下计数克隆数(含有50个细胞以上的集落计数为一个克隆)，计算克隆形成率。

1.10Transwell迁移实验：各组生长状态良好的细胞系，分别制备呈单个细胞悬液，并计数细胞浓度，按每孔200ul(含1×105个细胞)(无胎牛血清)，接种于24孔板Transwell小室(Corning Costar，USA)上室，下室加入含10%胎牛血清的培养基650ml，按常规方法培养24h，PBS溶液清洗3遍、多聚甲醛(4%)固定并晾干、结晶紫溶液(0.5%)染色，计数穿透上室并贴附于基底的细胞数(5个视野)。

1.11Transwell侵袭实验检测：Matrigel基质胶(Corning，USA)包被Transwell小室上室基底膜，待基质胶固化后接种细胞，其余步骤参照Transwell小室迁移实验。

1.12qRT-PCR实验检测：通过干扰载体影响各细胞系中LINC01133的相对表达后，提取总RNA，采用qRT-PCR实验检测各组细胞系中上皮-间充质转化相关标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)mRNA表达水平的变化，进而分析LINC01133对细胞上皮-间充质转化的影响。相关引物如下，E-cadherin上游5’-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3，下游5’-GGCCTTTTGACTGTAATCACACC-3'，产物162bp；N-cadherin上游5’-CAACTTGCCAGAAAACTCCAGG-3’，下游5’-ATGAAACCGGGCTATCTGCTC-3'，产物205bp；Vimentin上游5’-CGCCTGCAGGATGAGATTCAG-3’，下游5’-TCAGGGAGGAAAAGTTTGGAAGA-3’，产物175bp。

2 结 果

2.1与对照组(10例LSCC癌旁正常组织中LINC01133相对表达水平平均值，定义为对照组Pool[1])相比，LINC01133相对表达水平在LSCC细胞系中明显增高(见图1)。图1中Pool代表10例LSCC癌旁正常组织中LINC01133相对表达水平的平均值，与Pool相比，LSCC各细胞系中LINC01133相对表达水平明显增高(TU177，P=0.003；TU686，P=0.009；AMC-HN-8，P=0.002；TU212，P=0.160)。

图1 LINC01133在LSCC细胞系中的表达差异与Pool比较，1)P<0.05

2.2与配对癌旁正常组织相比，在48例LSCC组织样本中，28例癌组织中LINC01133表达增高(图2a，2b)，且从整体水平比较，LINC01133在癌组织中相对表达水平(3.71±2.47)明显高于其在配对癌旁正常组织中相对表达水平(3.04±2.05)，(P=0.012)(图2c)。

图2 LINC01133在LSCC组织样本中的表达趋势

2.3临床相关性分析提示，LINC01133相对表达水平与患者某些临床参数相关。低分化LSCC患者组织样本LINC01133相对表达水平(4.86±2.20)高于中-高分化组织样本(3.24±2.45)，(P=0.037)。晚期(Ⅲ～Ⅳ)组织样本LINC01133相对表达水平(4.29±2.71)明显高于早期(Ⅰ～Ⅱ)LSCC患者组织样本(2.65±1.52)，(P=0.026)。伴有颈部淋巴结转移的组织样本LINC01133相对表达水平(4.38±2.65)高于不伴有颈部淋巴结转移的LSCC患者组织样本(2.93±2.02)，(P=0.041)。而LINC01133相对表达水平与患者年龄、吸烟、饮酒无明显相关(P>0.05)。由于LSCC好发于男性，本研究48例样本，1例女性，故未进行相关分析。此外，LSCC亚解剖分型中，声门型居多，声门上型次之，而声门下型LSCC较为少见，本研究所采集样本中，仅有1例声门下型LSCC组织样本，故仅针对声门型、声门上型与LINC01133的相对表达水平进行了相关性分析，且未发现二者有明显相关性(P>0.05),见表2。

表2 LINC01133相对表达水平与临床病理特征相关性

2.4考虑LINC01133在LSCC各细胞系中的表达水平及载体转染效率，选择TU177细胞系用于shRNA载体功能实验，同时选择LINC01133相对表达水平较低的TU686细胞系进行pcDNA3.1(-)过表达载体的转染。靶向LINC01133的特异性shRNA载体，能够使得细胞系TU177中LINC01133的相对表达水平明显受到抑制，而4个shRNA均能不同程度的敲低LINC01133的表达，其中sh1-LINC01133效果最明显，故用于后续研究(图3a)。LINC01133过表达载体(pcDNA3.1(-)-LINC01133)能够明显增加细胞系TU686中LINC01133的表达(图3b)。

2.5体外功能实验提示，与对照组相比，敲低LINC01133的表达，能够抑制TU177细胞的增殖能力(图4a)，而过表达LINC01133，能够促进TU686细胞的增殖能力(图4b)。此外，与对照组相比，敲低LINC01133的表达，能够明显抑制TU177细胞的迁移(图4c)及侵袭能力(图4d)，而过表达LINC01133能够明显促进TU686细胞的迁移(图4e)及侵袭能力(图4f)。

图4 LINC01133表达改变对LSCC细胞恶性表型的作用

2.6通过载体降低LSCC细胞系TU177中LINC01133的表达，能够阻滞细胞的上皮-间充质转化进程的进展，而过表达细胞系TU686中LINC01133的表达，能够促进细胞的上皮-间充质转化进程(图5a，5b)。与对照组中E-cadherin(1.01±0.18)、N-cadherin(1.01±0.12)、Vementin(1.00±0.07)表达水平相比，敲低细胞系TU177中LINC01133的表达后，E-cadherin的表达上调(1.73±0.28)，P<0.05，而N-cadherin(0.47±0.12)、Vementin(0.54±0.06)的表达下调，P<0.01；与对照组中E-cadherin(0.91±0.10)、N-cadherin(1.00±0.08)、Vementin(1.00±0.10)表达水平相比，过表达细胞系TU686中LINC01133的表达后，E-cadherin的表达下调(0.63±0.06)，P<0.05，而N-cadherin(1.81±0.10)、Vementin(2.83±0.42)的表达上调，P<0.01。

图5 LINC01133对LSCC细胞系上皮-间充质转化进程的影响

3 讨 论

根据lncRNA与蛋白质编码基因在DNA的相互位置关系，可分为正义、反义、基因内、基因间和双向lncRNA等五种类型，而LINC01133属于基因间长链非编码RNA，能够促进多种肿瘤的恶性进展[4]。LINC01133可以诱导非小细胞肺癌细胞的体外增殖、迁移及侵袭能力，并能调控细胞周期进展和抑制细胞凋亡发生[5]。胰腺癌中LINC01133表达水平明显增高，可能通过Wnt信号通路，促进胰腺癌细胞的生长、增殖、迁移及侵袭能力[2]。最新研究发现，LINC01133可能通过激活PI3K/Akt途径促进肝癌的进展[3]。然而，目前LINC01133在LSCC中的表达及其功能尚不明确，既往研究发现，某些lncRNA如反义lncRNA ZNF667-AS1在LSCC中低表达，能够影响细胞恶性表型的进展[6]。

本研究证实LINC01133在LSCC组织及细胞系中的高表达，并与患者的临床分期、组织分化程度、颈部淋巴结转移状态相关，提示LINC01133的表达水平与LSCC的发生发展可能相关。进一步研究证实，LINC01133能够促进LSCC细胞系的增殖、迁移及侵袭能力。有研究表明，上皮-间充质转化在LSCC的发生发展中具有重要作用，而某些lncRNA能够通过不同途径参与上皮-间充质转化进程的调控。如MIR155HG通过miR-155-5p/XOS10信号通路促进LSCC的上皮-间充质转化进程及恶性表型的进展[7]。MEG3可以通过上调Twist1和Vimentin的表达并抑制E-cadherin的表达，进而促进LSCC细胞系Hep-2细胞的上皮-间充质转化进程[8]。另有研究表明，sirt1 AS通过直接靶向结合sirt1并增加其mRNA稳定性，从而能够抑制TGF-β1介导的上皮-间充质转化进程[9]。而本研究提示LINC01133可能通过抑制E-cadherin表达的同时，促进N-cadherin和Vementin的表达，从而对上皮-间充质转化具有一定的调控作用。但LINC01133对E-cadherin，N-cadherin和Vementin的具体作用机制尚需进一步深入研究。

综上，本研究证实了LINC01133在LSCC组织中的高表达与患者的临床分期、组织分化程度及颈部淋巴结转移阳性相关。研究同时发现LINC01133能够诱导LSCC细胞系恶性进展及上皮-间充质转化的进展，提示LINC01133可能通过上皮-间充质转化途径参与了LSCC的发生发展。本研究为后续LSCC相关标志物的筛选及靶向治疗中靶标的筛选具有一定的参考意义。