不同浓度木瓜蛋白酶腔内注射对大鼠膝骨关节炎造模成功率影响的实验研究

胡忠申 马晓博 敖日格勒 文振东 苗普达

(通辽市医院，内蒙古 通辽 028000)

膝关节骨关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)，是一种以膝关节软骨细胞凋亡增加、软骨细胞基质减少、软骨组织破坏及关节软骨表面粗糙或出现裂隙为特征的一种慢性、进行性疾病[1-5]。其主要的特点是：软骨退行性病变和骨质增生，严重或累及软骨下骨组织[6]。KOA多发于老年患者，且女性发病患者明显多于男性[7]。临床诊断以 X线摄片显示关节间隙狭窄、关节疼痛，多以负重痛或者行走痛为主，患者多关节肿胀、畸形，关节腔有积液[8]。膝骨关节炎是世界范围的一种老年多发性疾病，KOA发病率随着人口老龄化而逐年上升，严重影响人类的健康。作为临床上常见疾病，由于膝关节骨性关节炎的发生、发展和加重的机制还未完全阐明，临床上也缺乏相对有效的治疗措施[9]。因此，通过建立有效、可靠的膝关节骨关节炎动物模型来研究骨关节炎发病机制及防治具有十分重要的指导意义。骨关节炎动物模型的建立可以选择不同的动物通过多种因素诱发关节软骨退变来实现或者使实验动物自发[10-11]。本文通过木瓜蛋白酶关节腔内注射，使用不同浓度药物关节腔给药，探讨构建SD大鼠KOA模型的最佳方案。

1 材料与方法

1.1 用于造模的实验动物

选用 10周龄的雌性SPF级 SD大鼠 35只，体重180～270g；许可证号：SCXK（辽）2015-0003；提供单位：辽宁长生生物技术有限公司 ；实验室资质编号：2016029。动物分别放于不同笼内饲养，每日观察大鼠活动是否异常并记录体重、身长等变化。饲养动物所需的笼具及饮水瓶均由动物实验中心的实验室经高压灭菌后提供，饲养室 12 h明暗交替，温度控制在(25±2)℃，湿度为50%～70%。所有实验动物均为单笼饲养，自由饮水、摄食，饲养及管理条件一致。本实验方案经内蒙古民族大学动物伦理委员会审核批准，伦理审查批准编号:10/2019，所有动物实验操作均按照内蒙古民族大学实验动物中心的操作指南和中华人民共和国《实验动物管理条例》执行。

1.2 实验材料及试剂

戊巴比妥钠（上海市国药集团化学试剂有限公司）；注射用生理盐水（山西普兴生化工程有限公司）；木瓜蛋白酶（P 4762美国 Sigma公司）；L-半胱氨酸（C 5360美国 Sigma公司）；10%中性缓冲福尔马林固定液（北京益利精细化学品有限公司）；5%硝酸（上海君瑞生物技术有限公司）医用手术套装；无水乙醇（天津市风船试剂科技有限公司）；二甲苯（山西普兴生化工程有限公司）；苏木精-伊红染液（珠海贝索生物技术有限公司）；石蜡（德国 Leica公司）。

1.3 主要仪器

数字化X线成像系统（Digital Diagnost荷兰PHILIPS公司）；生物组织脱水机（ASP 300 S德国 Leica公司）；生物组织包埋机（EG 1160德国Leica公司）；石蜡切片机（RM 2245德国 Leica公司）；HRS-22D组织染色机（武汉汉谷医疗科技有限公司）；OLYPUS生物显微镜；100μl微量注射器 （上海高鸽）；组织包埋盒（江苏世泰实验器材有限公司）；显微镜载玻片（海门市神鹰实验器材厂）；DB066型足趾容积测量仪(北京汁鼠多宝生物科技有限公司)。

1.4 注射药物的制备

分别称取 2g、4g、8g的木瓜蛋白酶溶于3个盛有适量含0.03 mol/L L-半胱氨酸的缓冲液的量筒中，充分溶解后加PBS至100ml制成2%、4%、8%(w/v)木瓜蛋白酶混合溶液,静置30min后，0.22μm滤膜过滤，4℃备用。

1.5 实验动物分组及造模

适应性喂养1周后将大鼠随机分为 2% 木瓜蛋白酶组10只、4% 木瓜蛋白酶组10只、8% 木瓜蛋白酶组10只和生理盐水对照组5只。实验开始的第1d、3d、5d分组行右膝关节腔内注射。分组后将大鼠予浓度为 0.6% 的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为 30 mg/kg 。麻醉以后用动物剃毛器将大鼠右侧后腿膝关节周围皮肤表面毛发剔除并用聚维酮碘消毒，使用 100μl规格的注射器给每只 SD大鼠的右侧膝关节的关节腔注射 50μl配制药物及生理盐水，注射前左手拇指的指甲定位，然后让注射器的针尖沿着自己的大拇指指甲顺势插进指甲定位处，以腱外缘为进针点，稍向内下进针，穿过关节囊后即感到有落空感，此时开始注入。注射完成以后在注射处及其周围涂抹氯霉素软膏，防止出现感染情况。建模前在大鼠后肢踝关节上方0.5cm处做出标记，用足趾容积测量仪测量其容积，计算出其关节肿胀度，肿胀度(edema rate,ER)=(Vt-V0)/V0×100%。其中V0表示造模前的容积，Vt表示造模后的容积。造模期间持续观察大鼠运动的改变，称量并记录体重，测量关节宽度有无改变。

1.6 获取标本并检测

关节标本的处理方法：所有大鼠首次注射后第10周用颈椎脱臼法处死，在造模膝关节外 0.3cm处用锐利器械切断，整块取出关节标本。用 10% 甲醛固定48h，然后硝酸脱钙液脱钙 24h经脱水、透明、浸蜡及包埋制成石蜡标本，将石蜡标本切成5μm厚的石蜡切片，常规脱蜡蒸馏水冲洗片刻后，行HE染色，光学显微镜下观察软骨染色、软骨细胞、基质等软骨成分各层分布情况。

2 实验结果

2.1 动物一般情况及右膝关节宽度

实验大鼠35只，建模时各浓度组分别死亡1只，最终进入结果分析32只。造模组首次注射木瓜蛋白酶混合溶液24h后，大鼠表现出活动量减少，右膝关节出现明显肿胀，进食和食量无明显变化；第2次注射木瓜蛋白酶混合溶液后，大鼠活动明显减少，出现跳步、跛行，但关节肿胀较第1次减轻；第3次注射木瓜蛋白酶混合溶液后，各造模组上述表现无明显加重。而对照组大鼠 3次注射等量生理盐水期间进食和食量、活动情况、关节均未见明显异常。

实验结束时，使用 SPSS 13.0统计学软件进行单因素方差分析，各组体重间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。测量膝关节宽度结果表明，造模组大鼠右膝关节首次注射木瓜蛋白酶混合溶液 1周后出现明显肿胀，各造模组右膝关节宽度均与对照组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)；各造模组间右膝关节宽度比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2 。

表1 各组实验动物体重变化比较

表2 各组实验动物右膝关节肿胀度比较

2.2 影像学结果

影像学常用于临床上直观的检查关节病变，包括X线、MRI、关节镜和UR等[12-13]。X线可评估关节的骨质方面及关节间隙，是关节病变的常规检査，但是不能区分软组织的改变，无法提供早期的疾病影像学表现[14]。腹腔麻醉处死大鼠，大腿处进行备皮，用手术剪从髋关节处剪取下大鼠两个后肢，将大鼠左、右后肢分别以正、侧位固定于纸板，用X射线机拍摄各组大鼠膝关节正、侧位片。观察膝关节内外侧间隙是否均匀一致，髌股关节间隙有无变窄；关节内有无游离体；股骨髁、胫骨平台关节面轮廓是否清晰、光整，有无骨质增生、变尖，骨赘形成，骨密度是否均匀。

对照组膝关节正侧位 X线摄片表现，见图1A。由图1A可见，对照组膝关节正侧位片均未见明显异常。髁间嵴有轻微增生，关节面较光滑、关节面轮廓清晰完整关节内外侧间隙一致，未见明显狭窄。

实验组膝关节正侧位 X线摄片表现，见图1B 。由图1B可见，2%木瓜蛋白酶注射后，膝关节正侧位片均见髁间嵴有轻微增生，关节内外侧间隙一致，未见明显狭窄,骨性关节面较光滑、关节面轮廓清晰完整。图1C 4%木瓜蛋白酶注射后，髁间嵴及胫骨内侧缘增生，关节面轮廓不光滑，关节间隙略显变窄。图1D 8%木瓜蛋白酶注射后，关节内外侧间隙不一致、有变窄，关节面不光整、髁间嵴变尖，关节软骨高密度影。提示：关节腔注射木瓜蛋白酶后，均出现膝关节骨性关节炎表现。

图1 各组膝关节X线图片

2.3 形态学观察

在大鼠右膝关节上下 1cm处截取股骨髁和胫骨平台，进行大体观察。由图2可知，对照组图2-A膝关节软骨大体观察未见明显改变；图2B 2%木瓜蛋白酶组关节软骨光滑但有瑕疵，软骨乳白色、透明度低；图2C 4%木瓜蛋白酶组关节软骨色泽变暗、不光滑，少数软骨表面有缺失凹凸不平、呈灰白色；图2D 8%木瓜蛋白酶组关节软骨骨进一步损伤，少数软骨表面缺失、软骨下骨外露，损伤明显。

图2 各组膝关节表面大体观察

2.4 HE染色结果

正常软骨细胞石蜡切片 HE染色，细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色[15-18]。

光镜下对照组右膝关节软骨表面光滑平整，浅表层、中间层、辐射层及钙化软骨层4层结构清晰，细胞大小一致，排列规整，潮线完整（图3A）,染色正常。2% 木瓜蛋白酶组右膝关节软骨层明显变薄，软骨细胞变少，出现多重潮线（潮线复制），见图 3B；4% 木瓜蛋白酶组右膝关节软骨层厚度明显变薄，软骨细胞减少，体积大小不等，排列紊乱，并出现簇状增生细胞团，出现多重潮线（图3C）；8%木瓜蛋白酶组右膝关节软骨四层正常结构消失。大片软骨层崩解、脱落及坏死，存留的软骨细胞减少，大小不等，簇集现象明显，排列紊乱，潮线模糊甚至消失（图 3D）,图片有明显陷窝可见，提示软骨细胞大量凋亡。

图3 各组标本HE染色结果

3 讨论

膝骨关节炎动物造模可分为两大类[19-20]：①自发性模型，实验动物未经过有意识的人为处理，在自然条件下所自发的，或者由于基因突变的异常表现通过遗传育种保留下来的骨关节炎动物模型，如STRPort小鼠和Hartley豚鼠等；②诱发性模型，即通过各种实验性的人为操作来诱导产生的动物模型如关节腔注射物质，关节制动，关节内、外手术或人工筛选等。采用关节腔注射物质法制备OA模型，有实验操作简单、造模周期短、成功率高和造模方法适用于外用药物治疗等优点。狗、兔、豚鼠、大鼠、小鼠等动物，膝关节腔注射木瓜蛋白酶均可诱导成OA模型。大鼠的饲养条件要求简单，实验处理难度较低，常作为OA动物模型的首选动物。之前常见Wistar大鼠OA动物模型的报道,少有SD大鼠OA动物模型的报道，在研究有关药物的药理、毒理及药效学研究中，SD大鼠模型更适用，同时结合高龄女性OA发病率高的特点，本实验选用SD雌性大鼠，膝关节腔注射不同浓度木瓜蛋白酶和0.03mol/L的L-半胱氨酸混合液，诱导成不同损伤程度的OA动物模型，此模型软骨生化指标与OA患者一致，该模型更适用于OA治疗药物的药理、毒理和药效学等相关实验研究。

有报道[21-22]称，使用乌拉坦麻醉的动物作用时间较长，且浓度较高时动物易致死；水合氯醛和戊巴比妥钠的麻醉时间比较符合本实验中放射过程时长，但由于使用水合氯醛的动物麻醉时间并不稳定，所以最终选择 0.6%戊巴比妥钠溶液作为辐射试验麻醉药，注射计量为 40 mg/kg。

木瓜蛋白酶是从木瓜乳中分离提取的冻干粉，是肽酶C1家族的一种半胱氨酸蛋白酶。其由单一多肽链组成，含有3个二硫键和1个酶活性所必需的巯基。木瓜蛋白酶可消化大部分蛋白底物，比胰蛋白酶范围更广。木瓜蛋白酶具有广泛的特异性，可断裂基础氨基酸、亮氨酸或甘氨酸的肽键。它还能水解脂类和酰胺类化合物。木瓜蛋白酶更倾向于P2位置有大的疏水侧链的氨基酸，它不接受P1'位置的缬氨酸[23]。

L-半胱氨酸可用于作为木瓜蛋白酶消化液的添加剂，是一种蛋白质原性氨基酸，根据遗传密码与蛋白质结合，硫分子侧链参与细胞内的各种氧化/还原反应。侧链参与β 键的形成，调节蛋白质二级和三元结构。半胱氨酸是细胞内谷胱甘肽（一种重要的抗氧化剂）的形成必不可少且有限制作用[24]，本实验选用木瓜蛋白酶与0.03 mol/L L-半胱氨酸混合溶液以提高其活性。

4 结论

本研究通过对SD大鼠膝关节腔内注射不同浓度木瓜蛋白酶混合溶液，观察对比各组大鼠一般情况、膝关节宽度以及膝关节软骨病理切片，并对结果进行统计分析，得出以下结论：①膝关节腔内注射木瓜蛋白酶可构建大鼠膝OA模型；②大鼠膝OA的病理严重程度随木瓜蛋白酶的浓度加大而加重；③在大鼠膝关节腔内分别注射 2%、4%、8%(w/v)木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合溶液0.25 ml/kg可建立轻度、中度、重度的膝OA模型，周期短、可重复率高，且可用于中蒙药大规模动物实验，是相对理想的造模方法。