应用顶空-毛细管柱气相色谱法测定一次性无菌气管插管环氧乙烷残留量的研究

李平 王野 吴永芝

(天津美迪斯医疗用品有限公司，天津 300385)

气管插管用于插入患者气管和（或）支气管，为患者特别是不能自主呼吸或者手术中需要呼吸麻醉的患者创建一个临时性的人工呼吸通道。气管插管通常头部有一个或两个套囊，套囊充起后可以起到固定插管和密封气道的作用，防止异物进入呼吸道，保持呼吸道通畅，进行有效的人工或机械通气。插管管身通常由高分子材料制成，管身内埋有钢丝线圈，以提高径向强度和轴向柔软度。按照国家药品监督管理局2017年发布的《医疗器械分类目录》，气管插管归为“08-06呼吸、麻醉用管路、面罩”中的“03气管内插管/气管套管”，属于Ⅱ类医疗器械，要求无菌提供，一次性使用。

医疗器械常用的灭菌方式主要干热、湿热、环氧乙烷(Ethylene Oxide,EO)、辐照等。EO气体及其混合物作为一种有效的灭菌剂，主要用于不能进行湿热灭菌的医疗器械，即畏湿、畏热的医疗器械[1]。气管插管多使用PVC等医用高分子材料，受其耐受性等因素影响，现广泛使用EO灭菌。EO作为一种广谱低温灭菌剂，其作用原理是烷基化，通过对细胞中DNA、蛋白质（酶）等分子的不可逆作用导致分子功能丧失，细胞不再复制，继而死亡。其大量残留对人体具有遗传毒性、生殖毒性、致癌性等问题[2]，因而为了避免对使用者的身体造成伤害，检测EO残留量具有重要意义。

国家对经EO灭菌的一次性医疗用品出厂具有严格规定，即EO残留量不大于10μg/g[3]。EO残留检测方法根据GB/T14233.1-2008[4]有比色分析法和气相色谱法两种，而后者检测具有较强的选择性，且具有不受被测样品的成分和性质干扰的特点，适合各种材质医疗器械的EO残留测定[5]。目前，一次性无菌气管插管多采用填充柱气相色谱法，手工进样、柱效低、检出限较高[6]。本研究采用顶空-毛细管柱气相色谱法检测EO，简单、准确、快速，检出限低，精密度和准确度良好。

1 仪器与试药

1.1 仪器

气相色谱仪：岛津气相色谱仪GC2014C，火焰离子检测器(FID)；HS-10顶空进样器；色谱柱：毛细管柱Inert Cap 624，长度×直径×膜厚=30.0m×0.25mm×1.4μm。

1.2 试药

1.2.1 标准样品的配制

EO标准品(o2si smart solutions，上海安谱实验科技股份有限公司，Lot No.318517&373149)，浓度10000mg/L；稀释用水为灭菌注射用水（石家庄四药有限公司）；20ml顶空瓶及丁基顶空瓶盖。

1.2.2 一次性无菌气管插管

天津美迪斯医疗用品有限公司生产，ETT-X32-65，批号：20191213。

1.2.3 样品制备[7]

一次性无菌气管插管，主要由带囊管体、气源接头、单向阀或压力指示器等构成。样品制备选取与人体接触部分，按照要求采用极限浸提方法中的热浸提方法。

2 实验部分

2.1 色谱条件

气化室温度120℃，载气为氮气，分配比10，流量1.2mL/min，色谱柱温100 ℃，检测器温度160℃。按外标法以峰面积计算EO的含量。

2.2 正交实验

2.2.1 正交实验设计

根据GB/T9722-2006[8]，考虑EO本身的物化性质及所选气相色谱仪的特点等因素，主要选取样品提取的平衡温度、平衡时间和搅拌这3个因素。为了选择出检测EO的最佳实验条件，正交设计三水平三因素实验，采用正交表L9（34）安排实验，见表1。

表1 正交实验因素水平

2.2.2 正交实验结果及分析

实验结果数据见表2。从极差可以看出，对峰面积影响的因素主次顺序是A →B →C；从方差分析得出A在显著性水平α=0.10上是显著的。由此可以确定样品预处理的方法是顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间15min，无需搅拌。

3 验证部分[6,9-10]

按照优化实验参数，取平衡温度80℃，平衡时间15min，完成以下实验。

3.1 线性范围、回归方程和检出限

配制1～20μg/ml共7个浓度的标准溶液，精确量取5ml置于20ml顶空瓶中密封，按上述色谱条件测定峰面积。以EO标准液的浓度（μg/ml）为横坐标，以对应的峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。

EO浓度在5～100μg线性关系良好，相关系数为0.9998，回归方程为Y=8537.28X-2363.41。检出限按3倍基线噪音计算为0.06μg/ml。

表2 正交实验L9 (34)结果数据及极差分析、方差分析计算

3.2 专属性实验[11]

取未经EO灭菌的气管插管，剪成5mm的碎片，精密称取1.00g，放入20ml的顶空瓶中加8μg/ml的EO溶液5ml，密封后放入顶空进样器。用10μg/ml的EO溶液作为对照液，按照上述色谱条件测定，未经灭菌的气管插管如有杂质峰，应与EO峰基线分离，分离度R＞1.5。样品图谱见图1、图2。

由图1可得，未经EO灭菌的样品图谱无杂峰出现，与图2中8μg/mL的EO溶液对照品对比，结果明显，符合检定标准。

图1 未经环氧乙烷灭菌的样品图谱

3.3 准确度或回收率实验

精密称定EO适量，配制浓度为约4.8μg/mL、9.9μg/mL、19.8μg/mL的EO溶液各3份，分别按上述气相色谱方法测定，计算回收率，即测得值除以加入量。通过回收率高低判断准确度。回收率（%）=测得量/加入量×100%。回收率平均值应在90%～110%之间（n ≥9，至少3个浓度，每个浓度3份样品），相对标准偏差应≤5%（n ≥9，至少3个浓度，每个浓度3份样品）。EO溶液准确度试验数据见表3。

结果表明，按照上述色谱条件测定，3个标准样品的EO平均浓度分别为4.806μg/ml、10.023μg/ml和20.082μg/ml，相对标准偏差分别为0.32%、2.36%和2.14%。符合要求。

图2 8μg/mL环氧乙烷溶液图谱

表3 EO溶液准确度试验数据

3.4 精密度试验

分别取3个浓度的EO溶液5ml于顶空瓶中，连续进行6次测定，计算相对标准偏差。由相对标准偏差分析精密度，当≤5%时，表明精密度良好。结果见表4。

结果表明，按照上述色谱条件测定，3个EO的平均浓度分别为2.56μg/ml、5.69μg/ml和11.70μg/ml，相对标准偏差分别为0.74%、1.77%和2.54%，＜5%。该方法的精密度良好。

3.5 样品EO残留量试验

选取样品中与人体接触部分进行实验，将其截为5mm的碎片，精密称取1.0000g，放入20mL的顶空瓶中精密加水5mL，使样品充分浸泡在水中，密封后放入顶空进样器。EO测量结果按式（1）计算[7]。

上式中，CEO：产品中EO相对含量，μg/g；5：量取的浸提液体积，ml；c：标准曲线上得到的样品试液相应的浓度，μg/g；m：称样量，g。

样品EO残留量测定结果见表5。

4 讨论

气相色谱法相较于比色分析法测试EO，具有机械性高、重复性好等特点，渐渐成为各医疗器械单位的首选，但也提出了更高的技术要求。仪器的选择方面，该实验没有选择顶空手动进样，因为EO的易挥发性易造成精密度不高和结果不准确的情况。本实验采用顶空自动进样器，表现出了良好的精密度。另外，色谱柱选择中多推荐填充柱，但本实验中考虑到毛细管柱的普及性、使用方便、柱效高、灵敏度高等特点，选择的毛细管柱Inert Cap 624是中等极性气相毛细管色谱柱，适合于极性较小的EO。

表5 样品EO残留量

在方法学建立方面，气相色谱检测过程中其设定的操作参数较多，不仅仅需要确定检测参数，而且需要针对不同的医疗器械确定不同的前处理参数，包括平衡时间、平衡温度、搅拌频率等。正交实验是处理多因素实验中比较常用且较为科学的方法，各个因素之间具有均匀分散和整齐可比的特点。相比较于单因素优选法，正交实验法更具有代表性，容易区分因素影响的主次顺序，用较少的试验次数获得各因素对效应指标的影响，通过数理统计方法对实验结果进行分析，获取最佳或者较理想的实验条件或参数[12]，缩短了样品检测周期和条件优化时间，更加适合实际应用。本文通过正交试验建立气相色谱法测定EO的方法，希望能为其他医疗器械单位的检测方法确立提供参考，保证快速、高效、准确地检测出EO残留量，确保相关一次性使用无菌医疗器械的安全性。

此次实验使用正交实验的方法，对峰面积进行量化评价，通过极差分析和方差分析计算，最佳水平组合为A3B1C1，即平衡温度80℃，平衡时间15min，无需搅拌。继而，根据选定参数进行线性试验、准确度试验、精密度试验等，证明该法灵敏度高、精密度和准确度良好，能够用于一次性无菌气管插管的EO残留量检测。