肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1全长及其截短体对人前列腺癌细胞生物功能的影响

刘浩云，裴 斐,2

前列腺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，在欧美国家常年位居男性恶性肿瘤的发病率首位[1]。近年我国前列腺癌的发病率也呈明显上升趋势[2-3]。肿瘤转移是多数癌症患者死亡的最终原因。肿瘤转移抑制基因1(tumor metastasis suppressor gene1, TMSG1)[4-5]与肿瘤转移密切相关，又被称为人源长寿保障基因2(homo sapiens longevity assurance homologue 2, LASS2)[6]以及神经酰胺合成酶2(ceramide synthase 2, CerS2)[7]。LASS2/TMSG1定位于1q21.3，包含10个外显子，基因全长2 029 bp。LASS2/TMSG1编码一个含有380个氨基酸，相对分子质量为4.5×104的蛋白。生物信息学分析LASS2/TMSG1主要由Homeobox(Hox)结构域(71-128aa)以及TLC结构域(131-332aa)构成，其中Hox结构域内包含一个核定位信号(119-128aa)。

本实验旨在构建LASS2/TMSG1基因全长质粒以及3个结构域缺失质粒，并稳定转染到人前列腺癌高转移细胞系PC-3M-1E8中，以进一步探究LASS2/TMSG1基因中TLC结构域、Hox结构域以及Hox结构域中的核定位信号序列对人前列腺癌细胞生物学功能的影响，并探讨是LASS2/TMSG1基因中哪个结构域对其发挥抑制肿瘤生长、转移和侵袭的作用。

1 材料与方法

1.1 材料嘌呤霉素(Puromycin)购自美国Amresco公司；Polybrene(Hexadimethrine bromide Matrigel)购自北京普利智诚公司；DAPI染液购自北京索莱宝公司；Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG购自北京博奥森公司；Matrigel购自美国BD公司；FLAG M2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；Transwell-24膜嵌套(6.5 mm直径，8.0 μm孔径PC膜)购自美国Corning公司。

1.2 LASS2基因全长以及3个截短体引物设计使用GenBankΔ数据库检索基因cDNA序列，使用软件Premier 5.0软件进行引物设计。

1.3 LASS2基因全长以及3个截短体质粒构建T1(Δ71-128)去除了Hox结构域；T2(Δ128-332)去除TLC结构域；T3(Δ118-128)去除了Hox结构域中的核定位信号(图1)。以LASS2-pcDNA3.0质粒为模板，采用非依赖DNA聚合酶的连接方法(Exonuclease Ⅲ购自日本Takara公司)进行连接。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR反应产物回收后与载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro)混合在Exonuclease Ⅲ反应体系中4 ℃冰浴1 h，加入感受态细胞中转化30 min，45 ℃热激90 s，4 ℃冰浴2 min，将反应产物涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃ 14～16 h，挑选单克隆并行菌液PCR检测，检测符合者送测序。

图1 LASS2基因全长以及3个截短体序列示意图

1.4 Western blot法将细胞用RIPA裂解液裂解后提取细胞总蛋白，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，200 mA稳流湿转2 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗FLAG M2(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜；TBST洗脱3次，每次10 min；二抗(1 ∶5 000)室温孵育1 h；TBST洗脱3次，每次10 min；ECL发光液按照A液 ∶B液=1 ∶1的比例进行配置，化学发光仪检测化学发光信号。

1.5 细胞免疫荧光实验在6孔板底部放上多聚赖氨酸处理的玻片，将细胞接种于6孔板中，于孵育箱中培养，待细胞密度长至70%～80%时，PBS漂洗细胞2次，4%多聚甲醛室温固定15 min；PBS洗涤细胞10 min；0.1%TritonX100室温孵育10 min；PBS洗涤细胞3次，每次10 min；1%山羊血清室温封闭1 h；一抗FLAG M2(1 ∶1 600)4 ℃孵育过夜；PBS洗涤细胞3次，每次10 min；二抗Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG(1 ∶500)室温避光孵育1 h；PBS洗涤细胞3次，每次10 min；DAPI染核(1 ∶100)，室温避光孵育10 min；PBS洗涤细胞10 min；90%甘油封片。实验重复3次。

1.6 软琼脂集落形成实验底层软琼脂配制：配制0.8%低熔点琼脂糖并高压灭菌，6孔板每孔按照体积比为：0.8%低熔点琼脂糖 ∶2×DMEM ∶小牛血清=4.5 ∶4.5 ∶1的比例配制底层胶液体，6孔板每孔加入3 mL，每种细胞设置3个复孔，4 ℃放置30 min；上层胶用1.2%低熔点琼脂糖，其余同底层胶。取150 μL细胞密度为1×104/mL的细胞悬液加入上层软琼脂液体中并混合均匀，6孔板每孔加入3 mL，4 ℃放置30 min；于孵育箱中培养21天；于倒置显微镜下进行细胞集落计数以及细胞集落直径测量。实验重复3次。

1.7 细胞划痕修复实验将细胞以每孔3×105个的数量接种于6孔板中，设置3个复孔，于孵育箱中培养48 h，待细胞单层生长铺满孔底，用10 μL无菌枪尖以直尺为标准在孔底进行划痕，每孔等距离平行划痕5道；PBS溶液清洗至无细胞碎片为止，每孔加入2 mL不含血清的RPMI 1640培养液，于孵育箱中培养，用倒置显微镜观察并采集每孔细胞在划痕后0、9、18 h时的细胞图像并计量迁移速率。实验重复3次。

1.8 Transwell细胞侵袭实验在Transwell小室的下室中加入30%小牛血清200 μL作为趋化因子，在Transwell小室的聚碳酸酯膜(PC膜)上加入50 μL的用无血清DMEM培养液稀释的Matrigel(1 ∶7)，将整个24孔板放置于37 ℃培养箱中聚合30 min。将细胞以1×105的数量，总体积150 μL均匀地加入Transwell小室的上室，设置3个复孔，于孵育箱中培养48 h后吸去Transwell小室上室的多余液体，4%多聚甲醛室温固定15 min；0.1%结晶紫溶液室温染色15 min；PBS溶液洗去多余染液，倒置显微镜观察并进行图像采集。实验重复3次。

2 结果

2.1 构建稳定转染LASS2基因全长以及3个截短体的人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8以LASS2/TMSG1-pcDNA3.0质粒为模板，采用非依赖DNA连接酶的连接方法构建慢病毒质粒系统，其中，T1截短体全长972 bp，T2截短体全长534 bp，T3截短体全长1 114 bp，LASS2全长1 143 bp(图2A)。随后，采用慢病毒感染人前列腺癌高转移潜能细胞系PC-3M-1E8(LASS2/TMSG1低表达)，并利用慢病毒质粒系统所带有的嘌呤霉素抗性基因进行筛选，得到稳定细胞系后再采用Western blot法进行检测，实验结果显示，LASS2/TMSG1全长蛋白分子质量在(4.0～5.0)×104之间(实际分子质量为4.5×104)，T1截短体蛋白分子质量在(3.5～4.0)×104之间，T2截短体蛋白分子质量在(1.5～2.5)×104之间，T3截短体蛋白分子质量在(4.0～5.0)×104之间(图2B)。与预测的分子质量相符合：T1截短体蛋白分子质量35.64×103，T2截短体蛋白分子质量19.58×103，T3截短体蛋白分子质量40.85×103。

图2 A.菌液PCR技术检测构建的LASS2基因全长质粒以及3个截短体质粒；B.Western blot法检测构建的LASS2基因全长以及3个截短体质粒所表达的蛋白

2.2 人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8中LASS2基因全长以及3个截短体蛋白的分布应用免疫荧光技术对LASS2基因全长以及3个截短体所表达的蛋白进行追踪并利用激光共聚焦显微镜对结果进行观察，在稳定转染LASS2基因全长以及3个截短体的人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞中均可见蛋白大部分定位于细胞质中(图3)。

2.3 LASS2基因全长以及3个截短体对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8增殖能力的影响采用软琼脂集落形成实验检测LASS2基因全长以及3个截短体序列对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞非锚定依赖性生长能力的影响，结果显示：Vector组集落数量远大于LASS2基因全长组(P<0.001)以及T1组(P<0.001)和T3组(P<0.001)，T2组集落数量与Vector组相比差异无显著性(图4A、B)。Vector组集落直径与LASS2基因全长组(P<0.001)以及T1组(P<0.001)、T2组(P<0.001)和T3组(P<0.001)组相比差异均有显著性(图4C)。

2.4 LASS2基因全长以及3个截短体对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞迁移能力的影响采用细胞划痕修复实验检测LASS2基因全长以及3个截短体序列对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞迁移能力的影响，计算18 h后细胞的划痕修复率，结果显示，Vector组划痕修复率与LASS2基因全长组(P<0.001)、T1组(P<0.001)、T2组(P<0.001)和T3组(P<0.001)组相比差异均有显著性(图5)。

2.5 LASS2基因全长以及3个截短体对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞侵袭能力的影响应用Transwell细胞侵袭实验检测LASS2基因全长以及3个截短体序列对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞侵袭能力的影响，结果显示，Vector组在细胞侵袭方面与LASS2基因全长组(P<0.001)、T1组(P<0.001)、T2组(P<0.001)和T3组(P<0.001)相比差异均有显著性(图6)。

3 讨论

LASS2/TMSG1在抑制肿瘤迁移方面具有重要作用。有研究表明，LASS2/TMSG1在低转移前列腺癌细胞系PC-3M-2B4中高表达，在高转移前列腺癌细胞系PC-3M-1E8中低表达[8]。同时，也有研究发现在高转移乳腺癌细胞系MDA-MB-231中过表达LASS2/TMSG1可以抑制细胞增殖能力、非锚定依赖性生长能力以及细胞侵袭能力[9]。

LASS2/TMSG1是由北京大学基础医学院病理学系肿瘤生物学研究室于1999年率先利用mRNA差异显示技术首次克隆出来的肿瘤转移抑制基因[4-5]。生物信息学分析主要由Hox结构域(71-128aa)以及TLC结构域(131-332aa)构成，其中Hox结构域内包含一个核定位信号(119-128aa)。

现有研究表明神经酰胺合成酶的催化活性位于TLC结构域[10-11]。在所有的Lag同源体中Lag模体对于发挥酶活性是必须的[11]。

本组构建的T2截短体就特异性的删除了LASS2基因的TLC结构域。根据实验结果显示，T2截短体对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞的影响具有双重性。稳定转染了LASS2基因T2截短体序列的人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞的增殖、迁移、侵袭均受显著抑制(P均<0.001)，在细胞凋亡方面以及非锚定依赖性生长方面并无明显改变，但在锚定依赖性生长(P<0.001)方面却显著增强。其中涉及的具体机制可能并不只限于神经酰胺所参与的信号通路，具体机制还有待分析。

图3 免疫荧光技术检测LASS2基因全长以及3个截短体基因序列所编码的蛋白在人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8中的分布情况

图4 A.软琼脂集落形成实验检测各稳定细胞系非锚定依赖性生长能力；B.在软琼脂集落形成实验中各稳定细胞系形成的克隆数统计结果；C.在软琼脂集落形成实验中各稳定细胞系形成的克隆直径统计结果；**P<0.05；***P<0.001；ns.差异无统计学意义

图5 A.细胞划痕修复实验检测各稳定细胞系的细胞迁移能力；B.各稳定细胞系18 h时的划痕修复率；***P<0.001

图6 A.Transwell细胞侵袭实验检测各稳定细胞系的细胞侵袭能力；B.48 h细胞侵袭数；***P<0.001

本实验构建的T1截短体特异性的删除LASS2基因的Hox结构域，T3截短体特异性的删除了LASS2基因Hox结构域中的核定位信号。Hox结构域在拥有Hox结构域的神经酰胺合成酶中的确切作用还未确定，但是也没有证据可以证明Hox结构域在神经酰胺合成酶家族中充当转录因子的作用。对于神经酰胺合成酶中的Hox结构域现有许多不同的观点存在，但综合这些观点可以得知神经酰胺合成酶中的Hox结构域并不具备充当转录因子识别特异性序列的作用，而是可能拥有其他重要的作用，例如调节神经酰胺合成酶的催化活性。以上论述也符合本实验中观察到的现象，在人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8以及人胚胎肾细胞HEK-293T中均可以见到LASS2基因全长序列以及3个截短体序列所编码的蛋白质大部分均定位于细胞质中，并未进入细胞核中行使转录调节的作用。

细胞内的微观世界纷繁复杂，正常的各项人体生理活动涉及许多复杂且精密的代谢调控以及信号转导，改变一个分子的表达或许涉及到许多我们还未发现的信号转导通路以及代谢活动。本实验结果显示，LASS2基因T1截短体序列与LASS2基因全长序列相比，对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞具有更明显的抑制作用，LASS2基因T2、T3截短体序列在对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞中则表现出了双重性。这些现象的背后一定涉及了许多未知的调控机制，还有待我们在后续工作中进行深入探索。