凋落物添加和移除对杉木人工林土壤水解酶活性及其化学计量比的影响

刘 仁,陈伏生,方向民,万松泽,卜文圣,王辉民,李建军,*

1 江西农业大学林学院江西省森林培育重点实验室,南昌 330045 2 江西农业大学鄱阳湖流域森林生态系统保护与修复国家林业和草原局重点实验室,南昌 330045 3 中国科学院地理科学与资源研究所生态系统网络观测与模拟重点实验室,北京 100101

土壤水解酶是土壤微生物和植物分泌的胞外酶,其活性和产量与土壤C、N、P养分有效性密切相关[1],主要包括：降解纤维素的β-1,4-葡萄糖苷酶(BG,β-1,4-glucosidase)和半纤维素酶(CB,cellobiase),降解几丁质和肽聚糖的β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG,β-1,4-N-acetylglucosaminidase),水解蛋白质和多肽的亮氨酸氨基肽酶(LAP,leucine aminopeptidase),分解有机磷的酸性(或碱性)磷酸酶(AP,acid or alkaline phosphatase),这些酶的活性比值被称为生态酶化学计量比,可用于指示土壤C、N、P三类养分的有效性以及土壤微生物C、N和P养分需求状况[2],因此生态酶化学计量比在驱动土壤C、N、P养分循环过程中发挥重要作用[3-4]。化学计量比理论是基于化学反应中反应物和生成物的相对数量关系,该理论也适用于土壤生态酶化学计量比[5]。目前,土壤生态酶化学计量比相关研究已成为生态系统养分循环的热点。研究发现,C水解酶(如：BG和CB)、N水解酶(如：NAG和LAP)和P水解酶(如：AP)活性分别与土壤中C、N和P 的有效性呈负相关关系[6],另外土壤酶活性及其化学计量比均受到土壤 pH、温湿度等因素的调控[7]。以往对土壤养分和生态酶化学计量比相结合的研究主要基于植物物种水平[8],且集中在全球和流域尺度[9-10],而在人工林生态系统中的变化规律仍不明确。

森林管理可以改变森林生态系统的结构和功能[11]。作为林下管理的常用方法,从森林中收集凋落物作为燃料和农场动物草垫的做法一直沿用至今[12]；以往研究表明,凋落物移除可能加剧人工林生态系统土壤养分和森林生产力的衰退过程[13]。全球气候变化背景下,氮沉降加剧和大气CO2浓度升高所产生的“施肥效应”可能增加树木的生产力,最终可能使凋落物的产量增加[14]。凋落物输入量的变化可以通过改变输入土壤中C、N、P等养分的数量和质量对森林生态系统内部养分循环产生影响[15]。研究发现：凋落物添加可以促进土壤C和其他养分的循环[16]；而凋落物移除可能对土壤养分循环过程产生负效应[17]或无显著影响[18]。关于凋落物添加和移除对土壤养分影响的研究开展了许多,然而就凋落物量改变如何调控土壤生物和非生物因素,进而对土壤生态酶化学计量比产生影响还需进行深入研究。

杉木(Cunninghamialanceolata)是我国南方最重要的速生优良用材树种。杉木的速生特性导致其在生长期间高效吸收土壤养分,而凋落物输入量的改变可能造成土壤养分输入和输出过程严重失衡[19],最终可能导致土壤酶活性比值发生相应变化。但从生态酶化学计量比角度来探讨凋落物量变化对土壤养分状况影响的研究较少。本区域一项研究探讨过土壤酶活性对凋落物输入量的响应[20],而从生态酶化学计量比的角度探讨凋落物处理效应的研究鲜有报道。为此,本试验以亚热带杉木人工林为研究对象,通过研究凋落物添加和移除处理后土壤理化性质和水解酶活性及其化学计量比的变化来检验凋落物输入量改变对土壤养分状况的影响,进而揭示凋落物添加和移除对土壤-酶化学计量特征发生变化的机制。根据已有研究,我们提出以下科学假设：(1)杉木人工林土壤通常处于养分贫瘠状态,微生物代谢可能受到限制,而凋落物移除通过减少养分的输入而使土壤养分限制加剧[21],最终可能刺激微生物分泌更多特异性胞外酶,使土壤酶活性增加,而凋落物添加可能使土壤酶活性降低或者变化不显著；(2)土壤酶化学计量比可以确定微生物养分需求与土壤养分供应之间的关系[8],因此我们推测土壤生态酶化学计量比与土壤养分化学计量比之间可能存在对应关系。本试验结果可能从生态酶化学计量比的角度来揭示亚热带杉木人工林凋落物添加和移除处理下土壤养分的响应和调控机制,这将有助于完善土壤生态酶化学计量比理论体系,同时也为不同林下管理对土壤养分影响的评估提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样地概况

试验样地位于江西省泰和县中国科学院千烟洲石溪林场(26°44′52″N,115°04′13″E),该区地处亚热带季风气候区,雨量充沛,四季分明,海拔102m,年平均气温17.9℃,年平均无霜期 280d,年平均降雨量1471mm,是典型的红壤丘陵地貌,成土母质多为红色砂岩、砂砾岩或泥岩以及河流冲积物[22]。试验样地为 1998 年人工种植的二代杉木纯林,2013年杉木平均高度为 13.6m,胸径为 11.4cm,郁闭度 76%,林龄为15a,坡向为东南方向,坡度为15°；林下灌木层主要物种有毛冬青(Ilexpubescens)、黄瑞木(Adinandramillettii)、紫珠(Callicarpabodinieri)和黄栀子(Gardeniajasminoides)等[23]。

1.2 试验设计

本试验始于2013年1月,在江西省吉安市泰和县千烟洲石溪林场杉木人工林设置4个30 m×30 m 样地(样地间设置>5m的缓冲带),随机排列。每个样地通过“十字形”壕沟(规格：长30m,宽0.3m和深度1m,降低样方间水分和养分的交换速率,壕沟以内1m范围为缓冲区,禁止缓冲区取样)分割成4个15m×15m样方[20]。在每个样地的4样方间随机安排本研究的3个凋落物处理,每个处理4次重复,合计12个小区。3个凋落物处理分别是凋落物移除(LR)：将样地内全部凋落物移出样地；凋落物添加(LA)：将从去除凋落物样地收集的凋落物均匀洒在样方内；对照(CK)：凋落物不做任何处理。由于杉木枝叶同时掉落,加之每月凋落物量较少,因此凋落物处理每月进行一次,保证凋落物处理效果。

1.3 样品采集

2018年7月,在每个15m×15m小样方内沿“Z”型布置12个取样点,首先用三角铲收集50cm×50cm方格内矿质层以上的腐殖质样品12份,混合均匀并用四分法采集约500g,装入无菌自封袋内,做好标记放入冰盒；然后用直径5cm的土钻在该方格内取3个点各采集0—5cm,5—10 cm土层土壤,并把12个取样点0—5cm和5—10 cm两土层分别钻取的36个土样混合,用四分法采集约500g土壤装入无菌自封袋内,做好标记放入冰盒,迅速带回实验室,去除石块、根系等其它杂质,然后依次过2 mm 孔径的土壤筛后分为两部分,一份放至4℃冰箱内进行冷藏保存测酶活性和速效氮,另一份土样风干测pH、SOC、TN、TP养分含量[20]。

1.4 样品分析

1.4.1土壤理化性质

1.4.2土壤酶活性

用荧光标记底物法测定5种土壤酶(BG、CB、NAG、LAP和AP)的活性[25]。将1.5g新鲜土壤加入125 mL的乙酸钠缓冲液(50 mol/L)中制备土壤悬浮液。在96微孔板中加入200 μL的土壤悬浮液和50 μL的底物(200 μmol/L)溶液。将微孔板置于20℃黑暗条件下培养4 h,每个孔中加入10 μL的NaOH溶液(1 mol/L),静置1 min后,用多功能酶标仪(SpectraMax M2,美国)在365 nm下激发,450 nm下检测荧光值。每个样品8个重复。

1.5 数据分析

本研究采用SPSS 19.0软件的双因素方差分析(Two-way ANOVA)中的最小显著性差异(LSD)法比较不同处理与不同土层间5种土壤酶活性、生态酶活性化学计量比和土壤理化性质的差异性,并采用 Pearson 相关分析土壤酶化学计量比与土壤理化性质之间的相关性,在此基础上利用Canoco5软件评价以土壤酶活性为响应变量,土壤基本理化性质及C、N、P 元素计量比为解释变量进行冗余分析RDA(P< 0.05),ln(BG+CB):ln(NAG+LAP)表示土壤酶化学计量C:N；ln(BG+CB):ln(AP)表示土壤酶化学计量C:P；ln(NAG+LAP):ln(AP)表示土壤酶化学计量N:P[1]。本研究的图形绘制均在Origin8.0中完成。

2 结果与分析

2.1 凋落物添加和移除处理对不同土层土壤理化性质的影响

2.2 凋落物添加和移除处理对不同土层土壤酶活性的影响

凋落物处理和土层均显著影响AP、BG、CB、NAG和LAP酶活性,凋落物处理与土层的交互作用对AP、BG、NAG和LAP酶活性影响显著(表1)。与CK相比较,LR使腐殖质层中的BG、CB、NAG和LAP酶活性均降低(P<0.05),而LA仅增加了腐殖质层AP活性,增幅为16.18%。就0—5cm土层而言,LA增加了土壤 CB和NAG活性,而LR对二者存在抑制作用；0—5cm土壤层中的AP、BG和LAP水解酶活性仅表现出显著的凋落物添加正效应,而对LR无影响。在5—10cm土层中,LA使BG、CB和LAP活性增加,而LR分别使AP和CB活性降低了37.56%和45.36%。比较3个土层土壤酶活性发现,3种处理下的AP和BG活性均表现为0—5cm和5—10cm土层低于腐殖质层(P<0.05),其中0—5cm和5—10cm土层间差异不显著。另外,在3种凋落物处理下CB、NAG和LAP 3种酶活性随土层深度的增加而显著降低(图1)。

表1 土层和凋落物处理对不同理化性质、酶活性及其化学计量比的影响的双因素方差分析(F值)

表2 凋落物添加和移除对杉木人工林不同土层下的土壤理化性质的影响

图1 凋落物添加和移除处理对不同土层的土壤水解酶的影响Fig.1 Effects of litter addition and removal treatment on soil hydrolytic enzymes in different soil layersCK：凋落物保留(对照)Control；LR：凋落物移除 Litter removal；LA：凋落物添加 Litter addition,Humus layer：腐殖质层;不同大写字母表示同一处理中不同深度土层之间的差异性,不同小写字母表示同一土层中不同处理之间的差异,AP：酸性磷酸酶Acid phosphatase；BG：β-葡萄糖苷酶β-glucosidase；CB：半纤维素酶Cellobioside； NAG：乙酰葡萄胺糖苷酶β-N-acetyl-glucosaminidase；LAP：亮氨酸基肽酶Leucine aminopeptidase

2.3 凋落物添加和移除处理对不同土层土壤养分和酶活性化学计量比的影响

土层对土壤养分和酶活性化学计量比的影响显著,凋落物处理只对C/N和C/P的影响显著,两者的交互作用显著影响C/N、C/P和酶活性化学计量比(表1)。LR增加了腐殖质层的N/P,而LA降低腐殖质层N/P,同时还增加了3个土层C/N、C/P。与CK相比较,LA使腐殖质层和0—5cm土壤层的ln(BG+CB):ln(NAG+LAP)分别减少了10.00%和17.60%,另外LR降低了0—5cm土壤层的ln(NAG+LAP):ln(AP) 和5—10cm土壤层的ln(BG+CB):ln(AP)。

在3种凋落物处理中, C/P、N/P和ln(NAG+LAP):ln(AP)均随土层深度的增加而降低,而ln(BG+CB):ln(NAG+LAP)和ln(BG+CB):ln(AP)则表现为腐殖质层高于0—5cm和5—10cm土层(表3)。

2.4 土壤理化性质与土壤水解酶活性及其化学计量比的相关分析

表3 凋落物添加和移除处理对不同土层的土壤养分和酶化学计量比的影响

图2 土壤理化性质与土壤水解酶活性的相关性Fig.2 Correlation between soil physical and chemical properties and soil hydrolytic enzyme activitySMC：土壤含水量 Soil moisture content；pH：土壤酸碱度 Soil pH；SOC：土壤有机碳 Soil organic carbon；TN：土壤总氮 Total nitrogen；TP：土壤总磷 Total 铵态氮 Ammonium 硝态氮 Nitrate nitrogen；C/N：碳氮比Carbon:nitrogen ratio；C/P：碳磷比Carbon:phosphorus ratio；N/P：氮磷比Nitrogen:phosphorus ratio, AP：酸性磷酸酶Acid phosphatase；BG：β-葡萄糖苷酶β-glucosidase；CB：半纤维素酶Cellobioside；LAP：亮氨酸基肽酶Leucine aminopeptidase；NAG：乙酰葡萄胺糖苷酶β-N-acetyl-glucosaminidase

表4 土壤理化性质与土壤酶活性化学计量比的相关性

3 讨论

3.1 凋落物添加和移除处理对土壤理化性质及酶活性的影响

土壤水解酶作为评价土壤微生物活性及土壤肥力的重要指标,其活性的高低直接影响养分循环的效率。本研究发现凋落物输入量的改变会对亚热带杉木人工林土壤酶活性产生显著的影响。与假设(1)不同,本研究发现LR显著降低了土壤AP、BG、CB、NAG和LAP酶的活性,该结果与欧洲落叶林[26]、温带落叶橡树林[27]、亚热带米槠人工林[28]和热带雨林[29]的凋落物移除试验研究结果一致,这些研究认为,LR通过限制土壤微生物碳源和酶促反应底物的供应来调控土壤微生物的生长,最终使土壤酶的活性降低[26-29]。虽然亚热带杉木人工林土壤养分有退化趋势,LR减弱了生态系统土壤养分回收强度[30],但根据前人的研究结果表明土壤养分缺乏可能会刺激微生物分泌更多胞外酶来获取限制性养分来弥补植物和微生物得生长,而在本研究中,与CK相比, LR处理后土壤SOC含量减少不显著,并未刺激微生物分泌更多的胞外酶,但LA处理后的土壤SOC显著提高,而且酶活性与土壤SOC含量呈正相关,土壤酶活性在LA处理下表现出显著的促进作用,说明了LA可能通过提高SOC的输入量来促进土壤微生物的生长和繁殖,最终导致土壤酶活性提高[31],但LR处理可能改变其他养分的输入影响微生物活性。

本研究中,腐殖质层N/P在LR处理中显著增加,而LA处理显著降低。结果表明在腐殖质层中,LR处理下,土壤微生物主要受P限制,而LA处理下的土壤微生物主要受到N限制。这是因为凋落物移除显著降低P的输入量,相反,凋落物添加显著增加土壤SOC和TP含量,但不改变TN,所以导致微生物可利用N减少,进而受到N限制。但是LR处理下的P水解酶和LA处理下的N水解酶活性及化学计量比间均为表现显著差异,这与假设(1)不符,这可能是因为微生物分泌的胞外酶的相对活性可能同时受土壤养分条件和微生物本身元素组成的共同影响,后者可能占主导地位[40],因此单纯从土壤酶活性角度可能不足以很好地反映土壤养分状况。另外,土壤酶活性随土层的加深呈逐渐下降的趋势,这与吴传敬等[41]研究结果一致。可能的解释为土壤腐殖质层聚集了较多的动植物残体的分解物,营养源丰富,水热和通气状况也相对较好,为微生物生长和繁殖提供良好的环境,促使腐殖质层土壤酶活性较高[42],而随着土层的加深,土壤养分含量均逐渐下降,养分供应的减少导致微生物生长受到限制,最终土壤酶活性降低。本研究可为亚热带杉木人工林土壤质量评估提供一定的参考依据。

3.2 凋落物添加和移除处理下土壤生态酶化学计量特征

土壤酶化学计量比是指示土壤微生物养分限制的重要因子[1],本研究发现,在LR和CK处理下0—5cm和5—10cm土层中土壤酶活性比ln(BG+CB):In(AP)和ln(NAG+LAP):ln(AP)均低于全球尺度上土壤酶活性比ln(BG+CB):In(AP)(0.62)和ln(NAG+LAP):In(AP)(0.44)[8],说明亚热带杉木人工林0—10cm土层微生物受到磷限制,这与大多数研究结果一致,以往研究通常认为热带和亚热带区域磷是生态系统生产力的主要限制因子[43]。在本研究中,LA处理下的土层土壤酶活性比ln(BG+CB):ln(AP)和ln(NAG+LAP):ln(AP)均高于相应全球酶化学计量比,表明凋落物添加在一定程度上缓解了土壤磷限制,而长期的凋落物移除处理因为磷归还量减少,最终加剧了土壤磷的限制。该差异表明磷可能是驱动土壤生态酶化学计量比内在的联系的关键因子[44]。另外,从本研究发现土壤含水量与ln(BG+CB):ln(NAG+LAP)间存在显著的负相关关系,而与ln(NAG+LAP):ln(AP)间呈正相关关系,这表明土壤含水量的提高会加剧土壤微生物N限制,从而导致土壤微生物产生合成更多分解N的NAG 和LAP酶,最终使土壤水解氮酶活性提高。该结果与袁萍[45]的研究结论一致。可能解释为土壤水分的有效性通常制约了微生物活性和土壤有机底物酶的有效性,从而改变了生态酶化学计量比[46]。以往研究还表明,土壤生态酶化学计量能够有效地衡量微生物对C、N和P养分的需求[47]。在本研究中我们发现土壤ln(BG+CB):ln(AP)和ln(NAG+LAP):ln(AP)均与SOC和有效氮含量间均呈显著的正相关关系,说明 SOC和有效氮含量增加,能够促进土壤微生物合成更多的C和N水解酶。这与Waring[48]关于土壤有效性养分会影响微生物养分利用效率而改变微生物酶活性的结果一致,也与乔航等[49]发现SOC可能是限制土壤酶化学计量比的关键因子研究结果一致。由于土壤养分化学计量仅反映土壤养分现状,而土壤酶化学计量比可以表征微生物养分利用现状,在本研究中,ln(BG+CB):ln(AP)和ln(NAG+LAP):ln(AP) 与土壤C/P和N/P呈极显著正相关,而ln(BG+CB):ln(NAG+LAP)与土壤 C/N间无相关关系,表明了土壤酶化学计量与土壤元素计量比存在一定的对应关系,这与本文科学假设基本(2)一致,但与Xu等[50]研究结果不一致。可能是土壤养分比土壤环境因子(如：温度、水分)对生态酶化学计量的影响更为强烈,从而加强了生态酶化学计量比和土壤化学计量比之间的联系[51-52]。

4 结论

杉木人工林生态系统中凋落物添加和移除后的土壤C、N、P水解酶活性与对照处理间存在显著差异。土壤C、N、P水解酶活性随土层深度的加深而降低。亚热带地区杉木人工林土壤受 P限制,而凋落物添加在一定程度上缓解了土壤磷限制,相反,凋落物移除因降低磷归还量,可能加重了土壤磷缺乏。该差异表明磷可能是驱动土壤生态酶化学计量比内在联系的关键因子。土壤SMC、SOC和有效氮含量是驱动土壤酶活性和改变酶化学计量比的关键因子,表明生态酶化学计量比可作为表征土壤当前养分有效性状况的重要指标,因此,在杉木人工林经营管理过程中,应长期注重水分、SOC和土壤氮磷有效性的管理。本研究结果可为亚热带杉木人工林土壤养分管理和可持续经营提供科学的理论依据。

致谢：感谢中国科学院千烟洲生态试验站对野外工作的帮助。