人凝血因子Ⅷ磷酸三丁酯残留量测定方法学研究

高红琴，武鹏慧

（山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治 046000）

磷酸三丁酯残留量测定法为气相色谱法，参照《中国药典》2015年版通则3205和相关文献对人凝血因子Ⅷ中磷酸三丁酯残留量测定方法进行了方法学研究。

1 仪器与试剂

仪器：GC-2010Pplus 气相色谱仪（日本岛津）；酸改性聚乙二醇毛细管柱（安捷伦）；AE240电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。试剂：磷酸三丁酯（sigma chemistry，批号：BCBP2237V）；磷酸三丙酯（sigma chemistry，批号：38196TJ）；正己烷（国药集团化学试剂有限公司，批号：20171031）；高氯酸（aladdin chemistry，批号：H1617042）；样品批号：20180901、20181002、20181003（山西康宝生物制品股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 人凝血因子Ⅷ磷酸三丁酯残留量测定方法

2.1.1 仪器条件

柱温140℃，气化室温度190℃，火焰离子化检测器，检测器温度210℃，载气（氮气）流速为60mL/min。

2.1.2 测定方法

内标溶液的制备：取磷酸三丙酯适量，用正己烷溶解并定量稀释制成每lmL 中约含400μg 的溶液。

对照品溶液的制备：取磷酸三丁酯对照品适量，精密称定，加正己烷溶解并定量稀释制成每lmL 中约含600μg 的溶液。

测定法：精密量取供试品3mL，置具塞玻璃离心管中，精密加内标溶液50μl 与1.5mol/L 高氯酸溶液0.75mL，振荡1分钟；置37℃水浴保温10min 后，再加正己烷4mL，振荡2分钟；以20000r/min 转离心20min，小心吸取上层正己烷，用氮气将其浓缩至约0.2mL（不能加热），取1.0μl 注入气相色谱仪。精密量取对照品溶液10μ1、20μ1、40μl、60μ1、80μ1，分别置已精密加水3mL 的具塞玻璃离心管中，再向各对照品管精密加内标溶液 50μ1，自“振荡1min”起，同法操作。以各磷酸三丁酯对照品峰面积与内标峰面积比，对磷酸三丁酯对照品溶液浓度作直线回归，求得直线回归方程，计算出供试品中磷酸三丁酯含量（μg/m1）。

2.2 方法学研究

（1）专属性：取磷酸三丁酯、磷酸三丙酯对照品溶液和溶剂正己烷各1.0μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。磷酸三丁酯峰保留时间为8.256、磷酸三丙酯峰保留时间为3.367、溶剂正己烷峰保留时间为0.746。

（2）系统适应性试验：精密量取磷酸三丁酯对照品溶液10μ1，置已精密加水3mL 的具塞玻璃离心管中，精密加内标溶液50μ1，自“振荡1min”起，依法操作，记录色谱图。理论板数按磷酸三丁酯峰计为11 080，磷酸三丁酯峰与磷酸三丙酯峰的分离度为21.358，磷酸三丁酯对照品溶液连续进样5次，所得磷酸三丁酯峰与磷酸三丙酯峰面积之比（f）分别为：1.245、1.245、1.247、1.248、1.248，相对标准偏差（RSD）为0.11%。

（3）检测限与定量限：按仪器噪音的3倍响应值测定检测限，10倍响应值测定定量限。

分别取磷酸三丁酯对照品适量，精密称定，加正己烷溶解并逐级稀释，精密量取该溶液10μL，置已精密加水3mL 的具塞玻璃离心管中，再向各对照品管精密加内标溶液 50μL，自“振荡1min”起，照测定法操作。响应值为仪器噪音的3倍时的浓度为检测限，响应值为仪器噪音的10倍时的浓度为定量限，所以检测限为0.2μg/mL，定量限为0.5μg/mL。

（4）线性关系及线性范围考察：取磷酸三丁酯对照品适量，精密称定，加正己烷溶解并定量稀释制成每lmL 中约含600μg 的溶液，精密量取该溶液0μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL，分别置已精密加水3mL 的具塞玻璃离心管中，再向各对照品管精密加内标溶液 50μL，自“振荡1min”起，照测定法操作。以各磷酸三丁酯对照品峰面积与内标峰面积比，对磷酸三丁酯对照品溶液浓度作直线回归，求得直线回归方程。直线回归相关系数应不低于0.990。

磷酸三丁酯回归方程：y=0.159x+0.036 3，R2=0.997。式中：y为磷酸三丁酯峰面积与内标峰面积的比值f，x为磷酸三丁酯浓度，单位为μg/mL。磷酸三丁酯浓度对f值的线性关系结果见表3。结果表明：磷酸三丁酯含量在2～16μg/mL 线性关系良好。

表1 磷酸三丁酯浓度对f值线性关系结果

（5）重复性试验：取供试品（批号：20180901），按测定方法测定6次磷酸三丁酯残留量，计算RSD。磷酸三丁酯残留量分别为0.6、0.6、0.7、0.6、0.5、0.6，RSD 值为9.6%，符合测定要求，表明实验方法精密度良好。

（6）中间精密度试验：取三批供试品（批号：20180901、20181002、20181003），由不同人员在不同日期进行磷酸三丁酯残留量测定，中间精密度试验结果见表2，说明该方法重复性较好。

表2 中间精密度试验结果

（7）耐用性：测定方法规定柱温140℃，气化室温度190℃，检测器温度210℃，载气（氮气）流速为60mL/min。为了考察检测条件对测定的影响，取三批供试品（批号：20180901、20181002、20181003）分别在不同条件下，测定磷酸三丁酯残留量结果见表3。

表3 耐用性试验结果

（8）回收率试验：精密量取供试品（批号：20180901）3mL，置具塞玻璃离心管中，分别精密加入对照品溶液10μL、20μL、40μL，再加入内标溶液50μL 与1.5mol/L 高氯酸溶液0.75mL，制成低、中、高三个浓度回收率溶液。

分别取高、中、低三个浓度回收率溶液各三份、供试品溶液及对照品溶液，自“振荡1min”起，依法操作，记录色谱图。进样1.0µL，计算磷酸三丁酯回收率。回收率范围应为80%～115%。

表4 回收率测定结果

样品回收率测定结果显示，磷酸三丁酯含量平均回收率91%，RSD 为5.1%（见表4）。结果表明：该方法具有良好的回收率。

3 结语

该气相色谱法检测限度0.2μg/mL，灵敏度高，操作过程简便、快速，并且该方法准确度好，精密度高，完全能够满足人凝血因子Ⅷ中磷酸三丁酯残留量的测定。