白芷总香豆素对痛经模型小鼠的影响

徐珊，刘鹏宇，何全中*

(1.新乡医学院第三附属医院，河南 新乡 453000；2.新乡医学院，河南 新乡 453000)

原发性痛经(Primary dysmenorrheal,PDM)是一种常见的妇科疾病，影响40%～50%的青春期育龄女性人群[1]。这种疾病的特点是在月经第1天或第2天出现剧烈的急性腹痛，但没有明显的盆腔病变[2]。这些症状可伴有腰痛、恶心、呕吐和腹泻等症状。以往的研究已经证明PDM与前列腺分泌异常增加有密切关系[3]。前列腺素水平异常可引起频繁或节律紊乱的子宫收缩，从而降低子宫血流量，被认为是导致月经痛的主要因素[1,4]。

非甾体抗炎药(NSAIDs)是PDM最常见的治疗方法[5]。此外，PDM还被证明与性激素和卵巢类固醇相关疾病有关。因此，口服避孕药也被用于治疗PDM[6]。尽管非甾体抗炎药和口服避孕药的疗效迅速且显著，但对肝、肾、胃肠功能甚至心脏系统都有许多副作用[7]。由于非甾体抗炎药和口服避孕药的这些缺点，中药被认为是治疗PDM的可行选择。

白芷为伞形科植物白芷[Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f]或杭白芷[Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.) Shanet Yuan]的干燥根。其性温，气芳香，味辛，微苦，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓等功效，此外，白芷还有活血的作用[8]。白芷在临床主要用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、白带和疮疡肿痛等证。而有关白芷治疗原发性痛经性疾病的相关研究并不多。既往研究发现，白芷的主要有效成分为香豆素类[9-10]，故本研究选择川产道地药材白芷的提取物-总香豆素(Total coumarin of Angelica dahurica，TCAD)为研究对象，旨在探究其是否可以用于治疗原发性痛经性疾病及其可能的作用机制，为其临床应用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试药

实验用川白芷饮片(批号：20180306)购于北京同仁堂新乡药店。白芷总香豆素的提取[11]：白芷粉末(10目)加入10倍量水加热至40 ℃，保温2 h后，3 000 r/min离心15 min，药渣中加入10倍量70%乙醇，加热回流2次，每次2 h，提取合并过滤液，旋转蒸发浓缩烘干得白芷香豆素。实验时用生理盐水(含0.5%吐温-80助溶)配成所需浓度的混悬液备用。

1.2 动物

清洁级昆明雌鼠，体质量(20±2)g,，购自河南省实验动物中心,许可证号：SCXK(豫)2015-0005。所有动物均饲养在温度为22 ℃～24 ℃，相对湿度为60%～65%的房间内，所有动物实验前禁食12 h，可自由饮水。

1.3 仪器与试剂

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程有限公司)；钙含量比色检测分析试剂盒(艾美捷科技有限公司)；小鼠β-内啡肽(β-EP)、血栓素B2(TXB2)ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；前列腺素F2α(PGF2α)ELISA试剂盒(厦门慧嘉生物科技有限公司)；6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)ELISA试剂盒(上海纪宁酶联生物科技有限公司)；酶标仪( Thermo Multiskun Mk3，美国赛默飞世尔科技公司)；张力换能器(成都泰盟软件有限公司)；BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟软件有限公司)。

1.4 PDM模型的建立及动物的分组、给药

根据陈景伟等报道的方法建立小鼠PDM模型[12]。60只雌性昆明小鼠分为6组(每组10只)，分别为正常组、模型组、阳性组和白芷总香豆素(TCAD)高、中、低剂量组。除正常组小鼠外，其余各组小鼠均连续灌胃戊酸雌二醇片12 d(每日0.5 mg/kg)。在造模期间，阳性组小鼠灌胃布洛芬(0.075 g/kg),实验组小鼠给予不同浓度白芷总香豆素(0.4、0.8、1.6 g/kg)12 d。正常组和模型组小鼠给予生理盐水(含0.5%吐温-80)。各组小鼠于末次给药后1 h腹腔注射催产素(2 U/只)。以小鼠后肢伸直，腹部内凹，臀部抬起为扭体指标。记录注射催产素后30 min内扭体次数并计算扭体反应抑制百分率。

抑制率(%)=(模型组扭体反应均数-给药组扭体反应均数) /模型组扭体反应均数×100%

1.5 血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及血浆β-内啡肽(β-EP)含量的检测

观察扭体反应30 min后，腹腔注射4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)麻醉。眼底静脉丛取血至不含抗凝剂试管中，室温静置1 h，3 000 r/min离心20 min，取上清即为血清。眼底静脉丛取血至枸橼酸钠抗凝管中，3 000 r/min离心20 min，取上清即为血浆。用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定血清SOD活力，比色法测定血清GSH-Px活力，硫代巴比妥酸(TBA)法测定血清MDA含量。使用小鼠β-内啡肽(β-EP)ELISA试剂盒检测血浆β-内啡肽含量。以上均严格按照说明书要求操作。

1.6 子宫组织前列腺素F2α(PGF2α)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)、血栓素B2(TXB2)和钙离子含量的测定

取血后，于冰上迅速取新鲜小鼠子宫组织，生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分。加入约10倍量生理盐水，匀浆器匀浆制成子宫内膜组织匀浆液，随后于4 ℃ 3 000 r/min 离心10 min，取上清液，待测。ELISA检测子宫组织前列腺素F2α(PGF2α)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)和血栓素B2(TXB2)的含量。以上均严格按说明书要求操作。

1.7 白芷总香豆素对原发性痛经小鼠子宫收缩频率和幅度的影响

参考文献[13]，将上述模型动物取血后，立即取小鼠子宫，置于冷洛氏液中清洗，取子宫角，不含脂肪组织，置于恒温浴槽中，在(37±0.1)℃(调节pH值至6.7)的洛氏溶液(20 mL)中孵育，并用气体(95% O2，5% CO2)鼓泡。子宫角一侧用手术丝固定在固定柱上，另一侧用张力传感器固定并连接BL-420F生物机能实验系统。子宫预负荷1.5 g张力，静置60 min，待子宫收缩频率和幅度稳定后，记录各组动物子宫平滑肌收缩曲线的频率和振幅。

1.8 白芷总香豆素对缩宫素引起正常大鼠离体子宫平滑肌收缩力的影响

参考文献[13]和[14]进行。雌性未孕小鼠(18～22 g)使用苯甲酸雌二醇(1 mg/kg)腹腔注射，连续3 d后，颈椎脱位处死，立即取小鼠子宫，置于冷洛氏液中清洗，取子宫角，不含脂肪组织，置于恒温浴槽中，在(37±0.1)℃(调节pH值至6.7)的洛氏溶液(20 mL)中孵育，并用气体(95% O2，5% CO2)鼓泡。子宫角一侧用手术丝固定在固定柱上，另一侧用张力传感器固定并连接BL-420F系统。子宫预负荷1.5 g张力，静置15 min。然后，加入催产素(0.02 U/mL)，使其反应15 min，引起收缩。之后分别向给浴槽中加入32 ℃的3个不同浓度白芷总香豆素溶液，使之在肌槽中终质量浓度分别为0.02 g/mL、0.04 g/mL及0.08 g/mL，观察给药后10 min离体子宫平滑肌的运动曲线。记录各组子宫平滑肌基线最大的上升高度，同时计算抑制率。

抑制率(%)=(缩宫素组基线的平均上升高度-药物组基线的平均上升高度)/缩宫素组基线的平均上升高度×100%

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 白芷总香豆素对小鼠扭体反应及潜伏期的影响

与正常组比较，模型组小鼠30 min内扭体反应次数明显增高(P< 0.01) ，扭体反应潜伏期明显缩短(P<0.01)。与模型组比较，TCAD中、高剂量组可显著地减少小鼠扭体反应次数(P<0.05，P<0.01)，延长扭体反应潜伏期(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 各组原发性痛经模型小鼠的潜伏期、扭体次数影响的比较

2.2 白芷总香豆素对痛经小鼠血清SOD、GSH-Px、MDA的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清中MDA含量明显增高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活力明显降低(P<0.01)，经TCAD中、高剂量处理后，可显著降低MDA含量(P<0.05，P<0.01)，升高SOD、GSH-Px活力(P<0.05，P<0.01)。见表2。

2.3 白芷总香豆素对痛经小鼠血浆β-EP含有量的影响

与正常组比较，模型组小鼠浆中β-EP含量明显降低(P<0.01)，经TCAD中、高剂量处理后，β-EP含量显著升高(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表2 各组痛经小鼠血清SOD、GSH-Px、MDA影响的比较

表3 各组痛经小鼠血浆β-EP含量及子宫组织PGF2α影响的比较

2.4 白芷总香豆素对痛经小鼠子宫组织PGF2α的影响

与正常组比较，模型组小鼠子宫内PGF2α含量明显升高(P<0.01),经TCAD中、高剂量处理后，PGF2α含量明显降低(P<0.05，P<0.01)。见表3。

2.5 白芷总香豆素对痛经小鼠子宫组织6-Keto-PGF1α、TXB2和6-keto-PGF1α/TXB2的影响

与正常组比较，模型组小鼠子宫内TXB2含量明显升高(P<0.01)，6-Keto-PGF1α含量明显降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α/TXB2下降,经TCAD处理后，与模型组比较，低、中、高剂量组TXB2含量明显降低(P<0.05，P<0.01)，高剂量组6-Keto-PGF1α含量明显增加(P<0.05),6-keto-PGF1α/TXB2随着TCAD剂量增加逐渐升高。见表4。

2.6 白芷总香豆素对原发性痛经模型小鼠离体子宫平滑肌收缩频率和幅度的影响

与正常组相比，模型组离体子宫平滑肌的收缩频率明显增多、收缩幅度明显降低(P<0.01),TCAD中、高剂量组离体子宫收缩频率明显低于模型组(P<0.05，P<0.01)，收缩幅度高于模型组(P<0.05)。见表5。

表4 各组痛经小鼠子宫组织6-Keto-PGF1α、TXB2和6-keto-PGF1α/TXB2影响的比较

表5 各组原发性痛经小鼠子宫收缩频率和幅度影响的比较

2.7 白芷总香豆素对缩宫素诱发子宫平滑肌痉挛性收缩作用的影响

与缩宫素组相比，终浓度为0.02 g/mL，0.04 g/mL及0.08 g/mL的白芷总香豆素组，子宫收缩基线上升的幅度显著降低 (P<0.05，P<0.01)。见表6。

表6 各组缩宫素诱发子宫平滑肌痉挛性收缩作用影响的比较

3 讨论

催产素诱发的小鼠模型被认为是痛经的药效学实验小鼠模型，并经常用于原发性痛经研究[15]。由于强烈急性腹痛是原发性痛经的主要临床症状，故以扭体反应为主要指标，以扭体次数为指标评价模型及实验药物的疗效。本研究中，白芷总香豆素可通过降低PDM模型小鼠的扭体反应而呈剂量依赖性地显示镇痛活性。另外，TCAD中、高剂量组离体子宫收缩频率明显低于模型组(P<0.05，P<0.01)，收缩幅度高于模型组(P<0.05)，说明白芷总香豆素可有效地抑制缩宫素引起的子宫平滑肌痉挛性收缩。与缩宫素组相比，终浓度为0.02 g/mL、0.04 g/mL及0.08 g/mL的白芷总香豆素组，子宫收缩基线上升的幅度显著降低(P<0.05，P<0.01)，说明白芷总香豆素可拮抗缩宫素诱发的小鼠子宫平滑肌的痉挛性收缩。

研究表明，PDM的病因是由于子宫前列腺素(PGs)分泌过多导致子宫收缩异常[16]。前列腺素F2α(PGF2α)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α，前列环素的稳定代谢物)和血栓素B2(TXB2，TXA2的代谢物)是在环氧化酶(COX)的作用下通过花生四烯酸产生的几种主要PGs，已被证明是PDM发病的主要因素[17-18]。PGF2α和TXA2分别是子宫收缩和血管收缩的强刺激物[19-20]。特别是前列腺素2α(PGF2α)，可刺激子宫收缩和缺血，导致月经痛[21]。因此，PGF2α和TXA2不仅可以增加子宫内的张力，减少血流，而且可以促进血栓形成。前列环素(PGI2)通过扩张血管、预防血小板聚集和血栓形成来缓解PDM症状[17,19,22]。由于PGI2和TXA2的半衰期非常短[23]，笔者通过检测它们的代谢物6-Keto-PGF1α和TXB2，以间接反映它们的水平。临床研究表明，PDM患者的PGF2α和TXB2水平明显高于无症状正常人[24]，而PDM患者的6-keto-PGF1α水平则相反[19-20]。同时6-keto-PGF1α/TXB2水平升高则被认为是PDM临床疗效的指标[19]。本研究中，与正常组比较，模型组小鼠子宫内PGF2α、TXB2含量明显升高(P<0.01)，6-Keto-PGF1α含量降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α/TXB2下降。经TCAD中、高剂量处理后，PGF2α、TXB2含量明显降低(P<0.05，P<0.01)，6-Keto-PGF1α含量增加(P<0.05)，6-keto-PGF1α/TXB2升高。

此外现代研究表明，β-内啡肽(β-EP)是一种神经内分泌激素，具有内源性镇痛作用[25]。本实验发现，TCAD可显著增加血浆的β-EP含量，这可能是其缓解PDM疼痛的机制之一。

有研究称PDM会导致脂质过氧化和氧化应激反应加速[7]，这将降低抗氧化酶活性如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)，并增加游离氧自由基及丙二醛(MDA)的水平[26]，从而导致更强和更频繁的子宫收缩和缺血。当发生子宫内膜异位症时，子宫肌层血流减少，子宫缺血导致脂质过氧化和氧化应激过多。脂质过氧化和氧化应激可能在PDM的基础机制中起重要作用[27]。MDA是脂质过氧化的最后产物，它反映了脂质过氧化程度[28]。GSH-Px是对抗自由基的最重要的抗氧化剂之一，并防止随后的脂质过氧化[29]。本研究中，与正常组比较，模型组小鼠血清中MDA含量明显增高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性明显降低(P<0.01)，而经TCAD中、高剂量处理后，可显著降低MDA含量(P<0.05，P<0.01)，升高SOD、GSH-Px活力(P<0.05，P<0.01)。这说明TCAD可能通过减轻肌层细胞的脂质过氧化和氧化应激而发挥抗PDM的潜在镇痛作用。

综上所述，白芷总香豆素能有效改善实验性PDM，其机制可能与抗氧化、降低PGF2α水平，升高6-keto-PGF1α/TXB2水平及β-内啡肽含量有关。