依普黄酮对骨质疏松成骨细胞增殖分化能力影响的研究

于书娟 刘洪臣

骨质疏松症的预防和治疗不仅是一个现代医学面临的问题，也是一个社会问题。在1993 年，骨质疏松症被定义为一种系统性的骨疾病，并且以骨量丢失，骨微结构退化，骨脆性和骨折增加为特点。由于全身骨量丢失和颌骨骨量丢失的相关性[1]，许多用于系统性骨质疏松症的药物用于研究对颌骨骨量的影响[2，3]。其中依普黄酮作为一种广受关注的药物，其在临床上的应用前景很大[4，5]。我们之前的实验研究已经发现来源于骨质疏松大鼠颌骨的成骨细胞在增殖和分化上均有改变[6]，并且低浓度的雌二醇对骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞的生物学活性有影响[7]。所以本研究主要关注依普黄酮对骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞增殖和分化的影响，从而更进一步探索依普黄酮在口腔医学上的应用，为颌骨骨质疏松的防治提供一定的研究基础。

1.材料和方法

1.1 动物模型 所有的动物实验均经过动物实验伦理委员会同意。20 只约三个月大的Sprague-Dawley (SD)大鼠(300g，军事医科院动物实验中心，北京，中国)，随机分成两个相同数量的组，一组作为假手术组，卵巢附近的一小块脂肪组织被摘除；另一组作为去势组，行双侧卵巢摘除术。

1.2 成骨细胞分离和培养 手术后12 周[8]，去势组和假手术组通过血清中雌二醇水平和颌骨骨密度等进行比较，成功建立骨质疏松动物模型后，全麻下处死去势组大鼠，无菌条件下取下颌骨，在文献基础上分离培养成骨细胞[6]。当培养的成骨细胞在培养板中融合到80%以上时，无血清培养基使成骨细胞同步化。将依普黄酮稀释，得到实验所需的浓度0M、10-9M、10-8M、10-7M 和10-6M。含不同浓度依普黄酮的培养基继续培养成骨细胞72h。然后进行四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)法、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨钙素(osteocalcin，OC)测定。

1.3 MTT 法 将成骨细胞接种在96 孔板中(1×104个细胞/ ml；200μl/ 孔)24 小时后，换成无血清培养基继续培养24 小时，使细胞同步化。然后用含不同浓度依普黄酮的培养基(0M、10-9M、10-8M、10-7M 和10-6M)分别培养72 小时。接着在每孔中加入20μl 的MTT 溶液，在37℃下持续孵育4 小时。抽吸MTT 培养基后，用二甲基亚砜取代。在酶联免疫吸附检测器(ELx800 紫外型，Bio-Tek，美国)上以490 nm 的波长读取数值。

1.4 碱性磷酸酶活性测定 将成骨细胞接种于12 孔板(1×105细胞/ ml；1ml/ 孔)中，在5%CO2和37℃下生长。第二天，用无血清培养基将细胞同步化培养24 小时，然后分别加入所配制浓度依普黄酮的培养基继续培养72 小时。用PBS 清洗成骨细胞后，加入0.1%Triton X-100(300μl)在4℃下过夜裂解。将50μl 裂解物转移到另一96 孔板中，并添加50μl 的4.5mmol/ l 对硝基苯磷酸盐。然后将该96 孔板在37℃下再孵育30 分钟。向每个孔中添加50μl 的0.1M 氢氧化钠终止反应。在405nm 波长下测量产物的光密度。采用蛋白质分析(BCA 蛋白分析试剂盒，博斯特，中国)使蛋白质一致化。

1.5 骨钙素测定 将骨质疏松颌骨的成骨细胞接种于12 孔板(1×105细胞/ ml；1ml/ 孔)，并且用无血清培养基将细胞同步化培养24 小时后，分别加入所配制浓度的依普黄酮培养基继续培养72小时。收集细胞培养基，并使用自动电化学发光免疫分析法(瑞士罗氏Cobas E601)检测培养基中的骨钙素含量。

1.6 统计分析 结果用平均值±标准差表示。通过方差分析(ANOVA)进行统计分析，在达到统计显著性时进行适当的子检验。P 值等于或小于0.05 被认为是显著性的差别。

2.结果

2.1 成骨细胞生长观察结果 骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞(见图1)，在无药组中培养第5～7 天时，细胞铺满培养瓶。在依普黄酮干预组中，成骨细胞铺满培养瓶的速度明显提高，比对照组快约1～2 天。

图1 骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞(×100)

2.2 MTT 检测结果 依普黄酮干预培养骨质疏松颌骨成骨细胞后发现，含有依普黄酮组(10-9M、10-8M、10-7M 和10-6M)MTT 值均明显高于不含依普黄酮组(图2)，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。其中不同浓度之间也有明显差异(P＜0.05)，10-8M浓度的MTT 检测值最高，其次是10-9M、然后是10-6M 和10-7M。

图2 依普黄酮对骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞MTT 值检测的影响(*，P＜0.05)

2.3 碱性磷酸酶检测结果 通过检测成骨细胞碱性磷酸酶含量，并且蛋白质量一致后，结果(图3)显示含依普黄酮组碱性磷酸酶含量明显高于不含依普黄酮组，P＜0.01。各浓度之间有明显差异，表现规律与MTT 检测值规律和细胞的观察生长速度规律基本一致，并且，10-8M 组最高，P＜0.01。

图3 依普黄酮对骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞ALP 活性的影响(*，P＜0.01)

2.4 骨钙素分泌量 见图4。与不含依普黄酮组相比，依普黄酮组成骨细胞培养上清液中骨钙素分泌量明显增多，P＜0.01。各浓度之间也有明显差异(P＜0.01)，其表现规律与MTT 检测、ALP检测和细胞的观察生长速度规律略有不同，10-8M浓度的MTT 检测值最高，其次是10-7M、然后是10-6M，四种浓度中最低的是10-9M。

图4 依普黄酮对骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞骨钙素水平检测的影响(*，P＜0.01)

3.讨论

近年来，人们越来越关注系统性骨质疏松症对口腔颌骨的影响，有研究报道，发现骨质疏松症对种植体近中和远中的边缘骨丢失有显著影响[9]；并且骨质疏松症患者与牙周炎的临床附着丧失和牙槽骨骨丢失相关，骨质疏松症是牙周炎的一个高危因素，建议临床上牙周炎和骨质疏松症同时考虑[10]。同时建议种植体植入时要充分权衡使用治疗骨质疏松症的药物(如双磷酸盐类)对颌骨的影响[11]。依普黄酮作为一种有效的防治骨质疏松的药物，因为其较小的副作用在我国得到了广泛的应用。依普黄酮可以通过阻断Ihh 信号通路从而减轻软骨退变[12]。并且，还通过促进成骨细胞增殖和减少破骨细胞数量从而促进新骨生成和抑制骨吸收[13]；通过促进骨髓间充质干细胞成骨，改善骨质量并保护骨组织[14]。但是，由于颌骨含有牙齿有其独特性，对于依普黄酮对颌骨影响的研究很是必要。已经有研究报道依普黄酮可以增加颌骨骨小梁和骨皮质的骨密度，提示了依普黄酮对颌骨结构的影响[15]。我们通过对骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞的培养，为依普黄酮对颌骨影响的研究提供了一种更好的方式，也为口腔医学的进一步研究提供了细胞基础。

前期本研究组已经对骨质疏松动物模型的成功建立和去势组与假手术组之间的成骨细胞的区别进行过报道[6]。本次实验主要是研究依普黄酮对骨质疏松成骨细胞的影响。并且之前我们研究表明低浓度雌二醇对骨质疏松大鼠下颌骨成骨细胞有明显的促进增殖和分化的作用[7]。而依普黄酮对骨质疏松成骨细胞的影响，在本实验中，通过MTT 法、ALP 法和OC 法检测结果也表明，依普黄酮能促进成骨细胞的增殖，促进碱性磷酸酶和骨钙素分化，从而使成骨细胞发挥更大的作用，在整个成骨细胞和破骨细胞的骨平衡中占据更主要的地位，使得成骨大于破骨，对骨质疏松颌骨起到防治作用，相应地对骨质疏松症患者的种植手术的成功和长期效果也会起到一定的作用。同时，该研究还表明不同浓度的依普黄酮对骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞的增殖和分化能力影响不同，细胞的观察生长速度规律与MTT 检测值规律以及ALP 值规律基本一致，提示了该实验中不同浓度的依普黄酮对细胞增殖分化能力的影响有一定的规律，随着依普黄酮浓度的增加，对成骨细胞增殖分化的促进作用逐渐增强，然后随着药物浓度的增加，这种促进作用减弱，其中10-8M 对细胞的作用最大，从而为依普黄酮口腔医学上应用提供了一定的实验基础。对于依普黄酮对骨质疏松成骨细胞作用先增加后减弱的原因，可能是很多药物都有自身合适的治疗剂量，超过这个治疗剂量后，药物的作用可能出现质的变化，对机体产生不同程度的毒性或不良反应，对于骨质疏松成骨细胞来说，在本研究的研究药物剂量中，10-8M 是起到最大作用效果的一个安全药物浓度。但是有学者通过对M3T3 成骨细胞系的研究发现依普黄酮在10-10M 浓度时起到最大的促增殖分化的作用[16]。有差别的原因主要是因为所采用的细胞不同，也从侧面提示了对骨质疏松颌骨成骨细胞培养和研究的必要性。

当然，对于骨质疏松症在口腔医学领域的研究仍然需要更加深入，从而为口腔医学疾病的防治起到一定的作用。