间充质干细胞源性外泌体调控NF-κB信号通路抑制髓核细胞凋亡

肖 权，徐长明，王永超，周 全

0 引 言

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)严重危害公众健康[1]。干细胞移植是有效的治疗手段。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)能与髓核细胞直接接触亦能通过旁分泌促进髓核细胞增殖[2]。外泌体是旁分泌的主要介质，是具有生物学活性的微囊泡[3-4]。研究发现间充质干细胞可通过提送外泌体抑制髓核细胞凋亡缓解IDD[5]，但关于骨髓间充质干细胞源性外泌体(bone mesenchymal stem cell-derived exosomes，BMSC-Exo)抑制髓核细胞凋亡的机制尚不清楚。本研究拟探讨BMSC-Exo调控髓核细胞凋亡的可能机制，为IDD治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性6～8周大鼠8只，体重(200±20)g，购于徐州医科大学动物实验中心，许可证号：XZXK(苏)2019-0003，合格证号：201902056，实验大鼠采取光昼交替(光照时间：07：00-18:00)，温度25 ℃左右，湿度50%左右，通风良好，自由饮食饮水，适应性喂养7 d。本实验研究经过徐州医科大学动物伦理委员会批准(批准号：20190126)。

1.1.2 主要实验试剂伊思柯夫改良培养液(IMDM)、F12细胞培养基、胎牛血清(gibco)；成骨/成脂/成软骨诱导分化培养基(苏州赛业)；Ⅱ型胶原酶、内毒素、二硫氨基甲酸肽吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)、佛波醇酯、聚乙二醇辛基苯基醚(triton-X100)、Tween(Sigma) ；兔抗鼠Ⅱ型胶原、Cleaved Caspase-3、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)、β-actin抗体(Sigma)；HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德)；ECL试剂盒、PKH67染色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、Annexin V-APC/PI凋亡检测试剂盒、DAPI染色液 (北京百奥莱博)；兔抗鼠CD105/44/29/90/63/9、GAPDH和TSG101抗体(BD Biosciences)；RIPA裂解液 (江苏碧云天)。

1.1.3 主要实验仪器高速台式离心机(SKFH-1600RW，湖南湘仪)；超高速离心机(L-90K，Beckman)；荧光倒置显微镜(NIB900-FL，Olympus)；透射电镜(832.10w，北京京科瑞达)；Western blot检测装置(125-0098，Bio-Rad)；酶标仪器(HBS-1096A，上海研卉)；流式细胞仪(EpicsAltra，Beckman Coulter)；纳米颗粒跟踪分析仪(Nanosight NS300，Malvern)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物取材大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后拉颈处死，无菌条件下分离取出股骨、胫骨及尾椎髓核。

1.2.2 BMSCs的分离培养剪去股骨胫骨两端，无血清培养基冲洗骨髓腔，并吹打成单细胞悬液。4 ℃离心半径18 cm，1000 r/ min离心4 min，弃上清，加入红细胞裂解液，混匀，静置2 min。4 ℃离心半径18 cm，1000 r/ min离心4 min，弃上清。PBS洗涤2次。10%FBS的IMDM10 mL重悬，细胞培养箱内(37 ℃、5% CO2及饱和湿度)静置培养。48 h后首次换液，以后每2～3天换液1次。细胞长至80%～90%时消化传代。本实验中所用BMSCs均为P4代。

1.2.3 BMSCs的三系诱导分化鉴定取P4代BMSCs按6孔板5×104/孔密度接种，分为成脂诱导和成骨诱导。成脂诱导：细胞完全融合后交替使用成脂诱导培养基A液和B液诱导，3周后视情况油红O染色。成骨诱导：细胞融合至70%时加入成骨诱导培养基，3 d换液1次，3周后视情况茜素红染色。成软骨诱导：将4×105个BMSCs转移到15 mL离心管中，250×g离心4 min，弃上清，加入0.5 mL成软骨诱导培养基，150×g离心5 min，拧松管盖，静置于细胞培养箱中。3 d换液1次，3周视软骨球形成情况包埋切片，阿蓝利辛染色。

1.2.4 BMSC-Exo提取及鉴定P4代BMSCs长至80%时，换无血清IMDM培养48 h，收集上清后采用超高速离心法抽提外泌体：4 ℃，300×g离心10 min，保留上清液，继续4 ℃，2000×g离心10 min，保留上清液，继续4 ℃，10 000×g离心30 min，保留上清液，继续4 ℃，100 000×g离心70 min，保留沉淀，加入100～200 μL PBS稀释，-80 ℃保存备用。透射电镜观察外泌体形态。Western blot检测BMSCs和外泌体表面蛋白标志物。纳米颗粒跟踪分析仪观察外泌体颗粒直径分布。

1.2.5 PKH67/DAPI免疫荧光染色检测外泌体膜融合能力室温避光下取PKH67染色试剂盒母液2 μL与稀释液18 μL混合，再加入1×PBS 280 μL混匀，使PKH67母液250倍稀释。加入蛋白定量为100 μg的BMSC-Exo，混匀后室温孵育15 min。加入10 mL 1×PBS，再加入一半体积的外泌体提取试剂盒试剂，混匀，4 ℃静置1 h，10 000×g离心30 min，沉淀用200 μL 1×PBS重悬，即得PKH67标记的BMSC-Exo。将其与培养皿中贴壁的髓核细胞共孵48 h，多聚甲醛固定，PBST(1×PBS + 0.1% Triton X-100)洗3次，5 min/次。加3 mL1%BSA孵育30 min，PBST (1×PBS + 0.1% Tween)洗3次，5 min/次。加0.5 ug/mL DAPI染液3 mL，孵育5 min。PBST (1×PBS + 0.1% Tween)再洗3次，5 min/次。荧光倒置显微镜下观察拍照。

1.2.6 髓核细胞分离培养与鉴定剪碎髓核，Ⅱ型胶原酶消化90 min，滤去残渣。4 ℃，离心半径18 cm，1000 r/ min离心5 min。含10% FBS的F12培养基重悬，静置培养，适时传代。采用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定。

1.2.7 CCK-8检测髓核细胞活力将消化后的髓核细胞按照96孔板密度为：1×104/孔接种，细胞贴壁生长24 h后，采用不同浓度(0、100、200、500、1000 μg/mL)内毒素处理24 h，每个浓度6重复，每孔加入CCK-8溶液10 μL继续培养1 h，酶标仪设定波长450 nm检测各孔A值，以A值反映细胞活力。细胞成活率计算公式如下：

细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8内毒素)A值；Ac：内毒素浓度=0 μg/mL的细胞孔A值；Ab：空白孔(不含细胞和内毒素的培养基、CCK-8)A值，本实验中Ab=0.002。根据结果选择合适浓度的内毒素诱导髓核细胞凋亡。

1.2.8 检测NF-κB信号通路抑制后髓核细胞凋亡率的变化将消化后的髓核细胞按照6孔板密度为1×105/孔接种并分组：内毒素组、内毒素+PDTC组，细胞贴壁生长24 h后，去除细胞培养基，PBS润洗2次，分别加入内毒素500 μg/mL、内毒素500 μg/mL+PDTC 5 μmol/L各2 mL孵育24 h。流式细胞仪检测凋亡：按分组予不同试剂培养24 h后收集髓核细胞，制成细胞悬液，室温下采用Annexin V-FITC 和PI避光孵育15 min，1 h内用流式细胞仪检测。根据检测结果分析计算凋亡率，3次重复的实验结果进行统计分析得到总体细胞凋亡率。

1.2.9 检测内毒素、外泌体及NF-κB通路激活剂作用后髓核细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、p-IκBα蛋白的表达变化将消化后的髓核细胞按照6孔板密度为1×105/孔接种并分组：对照组、退变组、外泌体组、佛波醇酯组，细胞贴壁生长24 h后，去除细胞培养基，PBS润洗2次，分别加入基础培养液、内毒素500 μg/mL、内毒素500 μg/mL +外泌体20 μg、内毒素500 μg/mL+外泌体20 μg+佛波醇酯50 μg/mL各2 mL孵育24 h。流式细胞仪检测凋亡：方法同1.2.8。蛋白质免疫印迹：收集各组髓核细胞加RIPA裂解，蛋白质浓度定量，每孔上样30 μg SDS-PAGE凝胶电泳，切胶、转膜、孵育一抗(Cleaved Caspase-3、p-IκBα、β-actin)、二抗，加ECL试剂曝光，计算各条带灰度值，推算各组p-IκBα、Cleaved Caspase-3蛋白表达量。

a：原代BMSC细胞形态( ×100)；b：成脂诱导(油红O染色 ×100)；c：成骨诱导(茜素红染色 ×40)；d：成软骨诱导(阿蓝利辛染色 ×40)；e：电镜下观察BMSCs-Exo形态( ×50 000)图1 BMSC原代培养、三系诱导分化染色光镜下观察结果及外泌体电镜下观察

2 结 果

2.1 BMSC-Exo提取与鉴定BMSCs均匀生长，呈长梭形。成脂诱导分化油红O染色见细胞内有红色球形脂滴形成；成骨诱导分化茜素红染色见有黑色的钙结节形成；成软骨诱导分化形成小软骨球，切片后阿蓝利辛染色见淡蓝色糖胺聚糖积累。电镜下外泌体形态特征为杯托状结构。见图1。Western blot检测BMSCs特异性表达CD105、CD44、CD29、CD90，BMSCs-Exo表达CD63、CD9、TSG101，见图2。纳米颗粒跟踪分析仪显示外泌体直径多分布在100 nm。外泌体PKH67染色发绿色荧光，髓核细胞细胞核DAPI染色发蓝色荧光，共孵后外泌体在髓核细胞胞质中发绿色荧光，说明外泌体具有膜融合能力，可被髓核细胞摄取。见图3。

图2 Western blot检测外泌体以及BMSCs标志蛋白表达情况

a：纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体颗粒直径；b：DAPI；c：PKH67；d：共同显示图3 纳米颗粒跟踪分析仪及免疫荧光染色检测外泌体结果( ×200)

2.2 髓核细胞培养与鉴定原代髓核细胞培养14 d，形态转为长梭形，内含分泌颗粒。甲苯胺蓝染色细胞核呈蓝色，细胞外基质色稍浅，表明细胞可分泌糖胺多糖。Ⅱ型胶原免疫化学染色见细胞外基质被染成棕黄色，表明细胞质内有Ⅱ型胶原蛋白表达。见图4。

a：髓核细胞在光镜下形态特征；b：髓核细胞(甲苯胺蓝染色)；c：髓核细胞Ⅱ型胶原(免疫组化染色)图4 髓核细胞镜下形态及相关染色情况( ×40)

2.3 内毒素对髓核细胞细胞活力的影响CCK-8实验结果结果显示：相比于内毒素浓度0 μg/mL处理的细胞孔，其余各浓度的A值普遍降低，细胞存活率普遍下降(P<0.01)，各处理浓度下细胞存活率相对差异较大(F=383.8，P<0.0001)，见表1。由于500 μg/mL与1000 μg/mL处理后细胞存活率数值较为接近，差异无统计学意义(F=0.491，t=1.005，P=0.339)，因此后续研究中采用内毒素500 μg/mL浓度处理髓核细胞建立凋亡模型。

表1 CCK8检测不同浓度内毒素对髓核细胞A值及细胞存活率的影响

2.4 内毒素诱导髓核细胞凋亡涉及NF-κB通路内毒素+PDTC组细胞凋亡率[(11.55±0.86)%]较内毒素组[(28.63±2.86)%]明显降低(t=9.909，P=0.001)，PDTC抑制了NF-κB信号通路后内毒素诱导髓核细胞凋亡效率明显降低，这说明髓核细胞凋亡涉及NF-κB通路。见图5。

a：内毒素组；b：内毒素+PDTC组

2.5 BMSC-Exo通过抑制NF-κB通路抑制髓核细胞凋亡流式细胞仪检测的对照组凋亡率为(9.05±1.61)%，而退变组髓核细胞凋亡率升高至(29.48±2.83)%，差异有统计学意义(t=-10.874，P=0.000)；与退变组相比，外泌体组髓核细胞凋亡率下降至(15.08±1.65)%，差异有统计学意义(t=7.620，P=0.002)；与外泌体组相比，佛波醇酯组髓核细胞凋亡率增加至(25.41±1.38)%，差异有统计学意义(t=-8.323，P=0.001)。见图6。与对照组比较，退变组p-IκBα蛋白表达升高(t=-10.575，P=0.000)，Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(t=-8.506，P=0.001)；与退变组比较，外泌体组p-IκBα蛋白表达降低(t=10.052，P=0.001)，Cleaved Caspase-3蛋白表达降低(t=7.419，P=0.002)；与外泌体组比较，佛波醇酯组p-IκBα蛋白表达升高(t=-12.125，P=0.000)，Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(t=-8.421，P=0.001)。见图7。

a:对照组; b:退变组; c:外泌体组; d:佛波醇酯组图6 流式细胞仪检测髓核细胞凋亡情况

与对照组比较，*P<0.05；与退变组比较，#P<0.05；与外泌体组比较，△P<0.05图7 Western blot检测各组p-IκBα、Cleaved Caspase-3蛋白表达情况

3 讨 论

IDD机制尚不清楚，目前认为与髓核细胞炎症密切相关，炎症因子在其中发挥重要作用[6-7]。NF-κB是炎症因子的上游调控因子，研究发现抑制NF-κB活性可抑制炎症因子产生[8]。亦有研究发现退变椎间盘组织NF-κB含量较正常明显增高[9]，NF-κB通路抑制后，IDD明显减缓[10-11]。内毒素可通过活化NF-κB通路促进细胞凋亡[12]。PDTC是体外NF-κB通路研究常用的阻断剂，它能抑制IκBα磷酸化，阻止NF-κB入核，从而发挥通路阻断作用。因此，本研究采用内毒素作为诱导介质，建立髓核细胞细胞凋亡模型，加入PDCT作用于髓核凋亡细胞，流式细胞仪检测发现髓核细胞凋亡率明显下降，说明细胞凋亡确有NF-κB信号通路参与。

Caspase-3是执行凋亡的关键分子，作为Caspase-3的活化形式，Cleaved Caspase-3是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[13]。NF-κB蛋白二聚体与IκBα结合形成三聚体而失活存在细胞质中。当细胞收到激活信号后IκBα磷酸化从三聚体分离，而二聚体转入细胞核内，调节靶基因的表达[14]。因此IκBα的磷酸化(p-IκBα)是NF-κB信号通路活化的重要标志[15]。本研究用流式细胞仪检测凋亡率发现PDTC抑制NF-κB通路后，髓核细胞凋亡率明显下降，Western blot检测显示Cleaved Caspase-3和p-IκBα蛋白均明显下降，可见PDTC抑制了NK-κB信号通路，该通路与髓核细胞退变密切相关。

内毒素是人体中一种重要的促炎因子，它可诱导髓核细胞产生强烈炎症导致细胞凋亡，减少髓核细胞外细胞基质合成，在IDD过程中发挥重要作用[12]。本研究CCK-8实验发现随着内毒素浓度的增加A值逐步降低，而A值与细胞存活率呈正相关，并且内毒素500 μg/mL和1000 μg/mL处理组之间A值没有显著差异，因此我们选择内毒素500 μg/mL浓度建立髓核细胞凋亡模型。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，结果均显示内毒素有效诱导了髓核细胞凋亡。

外泌体是40～100 nm大小的微囊泡，内含生物活性物质[16]。研究表明，外泌体在细胞通讯和代谢调节等方面发挥重要作用[17]。BMSC-Exo可抑制炎症介质激活减少髓核细胞凋亡[18]。研究发现，外泌体达到有效治疗作用的最低剂量是10～100 μg[19],因此本实验选择20μg作为外泌体的实验剂量。外泌体分离方法主要有超速离心法、聚合物沉淀法、超滤法、免疫亲和法、显微射流分离技术等，超速离心法是“金标准”，使用最广泛[20]。本研究中即用该方法提取外泌体。国际细胞外囊泡学会规定外泌体的鉴定必须包括粒径大小、形态以及蛋白分子标记等三方面[19]。本研究通过纳米颗粒跟踪分析仪观察粒径大小、透射电镜观察形态及免疫印迹检测表面标志物对所提取的外泌体进行鉴定，同时通过免疫荧光检测证实其确实能被髓核细胞摄取。本研究通过流式细胞仪检测发现外泌体组的髓核细胞凋亡率明显下降，提示BMSC-Exo可被髓核细胞摄取并减轻其凋亡。

为研究BMSC-Exo对髓核细胞的抗凋亡机制，本研究采用NF-κB通路经典激活剂佛波醇酯，佛波醇酯可使IκBα磷酸化，促使NF-κB入核，从而活化NF-κB信号通路。通过流式细胞仪检测发现，外泌体组可以抑制内毒素导致的髓核细胞凋亡，而使用佛波醇酯激活NF-κB信号通路后，髓核细胞凋亡率升高，Western blot检测显示Cleaved Caspase-3和p-IκBα蛋白均明显升高，提示NK-κB信号通路被佛波醇酯激活，并且该信号通路激活后外泌体的抗凋亡作用基本被逆转。

综上所述，BMSC-Exo可以通过调控NF-κB信号通路抑制髓核细胞凋亡。以上研究初步揭示了BMSCs对髓核细胞凋亡的作用机制，为IDD的治疗提供了新思路。