络合萃取-反萃法制备异甘草素的工艺研究

石盘棋, 刘晓霞, 魏舒畅, 孙晓燕, 王继龙, 冯晓莉, 万玲娟, 李真真

(甘肃中医药大学 甘肃省中药制药工艺工程研究中心, 甘肃 兰州 730000)

1 前 言

异甘草素(isoliquiritigenin)是甘草中含有的羟基查耳酮类化合物[1]，属于黄酮苷元。作为甘草的有效成分，它具有抗肿瘤[2]、解痉、抗氧化、保护肝脏[3]、抗艾滋病[4]、抗糖尿病并发症[5]、抗溃疡[6]、抗炎[7]、抗菌、预防动脉粥样硬化[8]等药理作用。

前人对异甘草素的提取做了研究，水提取法会将淀粉、蛋白质等大分子物质一同提取出来，影响提取效果[9]；有机溶剂提取法有机溶剂用量大，收率不高，不利于大规模生产[10]；超声提取法噪声大、需耗能[11]；微波提取法的耗能、传热和传质不均匀是其明显的缺陷[12]。酶提取法试剂费用昂贵，成本高[13]。目前常用的异甘草素物理液液萃取法具有有机溶剂用量大、溶剂回收成本高、溶剂夹带损失大、产品中溶剂易残留等缺点[14]；二氧化碳超临界萃取存在设备昂贵、对温度和压力要求高等缺点[15]；制备色谱由于所得目标物质量少，色谱柱填料用量大，使得制备效率低、生产成本高等缺点[16]。

甘草总黄酮包括黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查耳酮类、二氢黄酮类、二氢查耳酮类等[17]。本文在对甘草提取液进行超滤除去大量杂质的基础上，对其中的异甘草素采用络合萃取反萃取制备方法[18-19]进行研究。稀释剂和络合剂是络合萃取剂重要的组成部分[20]，磺化煤油稀释剂能改善萃取体系黏度、增大异甘草素溶解度；磷酸三丁酯（tributyl phosphate, TBP）和三烷基氧化膦（trialkylphosphine oxide, TRPO）络合剂具有官能团G3P=O，而异甘草素结构中含有酚羟基，过氧原子上的孤对电子与异甘草素酚羟基上的氢质子反应形成萃取物，从而将甘草超滤液中的异甘草素萃取出来。通过络合萃取剂和反萃取剂优选、甘草超滤液中异甘草素络合萃取和反萃取条件，以期开发一种制备异甘草素的新技术，使以异甘草素为原料的新药创制成为可能，也为甘草总黄酮的质量控制提供了便利条件。

2 仪器与试药

Agilent-1260型液相色谱仪(美国Agilgent公司)，色谱柱为Hypersil BDS-C18键合硅胶柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；AKRY-UP-1816 型超纯水机(成都唐氏康宁科技发展有限公司)；SJM 陶瓷超滤膜(合肥世杰膜工程有限公司)；MX-RL-Pro LCD 数控旋转混匀仪(大龙兴创实验仪器北京有限公司)；DD-5M 型湘仪离心机(湘仪离心机仪器有限责任公司)；DZF-6090 真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

三烷基氧化膦(溧阳市凯信化工有限公司)，磷酸三丁酯(分析纯，烟台市双双化工有限公司)，磺化煤油(广东正茂石化有限公司)，石油醚(分析纯，沸程60～90 ℃，天津市进丰化工有限公司)，乙腈(色谱纯，天津市大帽化学试剂厂)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

甘草饮片购于兰州市黄河药材市场，经甘肃中医药大学药学院魏舒畅教授鉴定为Glycyrrhiza uralensis Fish.；异甘草素对照品(批号961-29-5，含量以98% 计)，北京北纳创连生物研究院。

3 方法与结果

3.1 甘草的提取、超滤工艺

称取一定量甘草药材，用24 倍量0.75% 的氨水回流提取3 次，每次用8 倍量提取1 h，合并提取液。静置取上清液，下层浊液经3 000 r·min-1离心机离心15 min，收集上清液，合并2 次上清液，用无机陶瓷膜在孔径10 nm、压力0.12 MPa 、温度25 ℃下超滤，得甘草超滤液，浓缩至0.2 g·mL-1，备用[21]。

3.2 异甘草素的含量测定

3.2.1 对照品溶液的制备

取异甘草素对照品适量，精密称重，加70% 乙醇制成含异甘草素4.04 µg·mL-1的对照品溶液，备用。

3.2.2 供试品溶液的制备

量取0.2 g·mL-1甘草超滤液、络合萃取后的萃余液、反萃取液各1 mL 于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

3.2.3 色谱条件

参照《中国药典》2015 年版一部[22]甘草项下及其他相关文献[23]报道的高效液相色谱测定条件，采用Hypersil BDS-C18 键合硅胶柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.05% 磷酸水溶液(体积比50:50)为流动相，检测波长为370 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL，流量1.0 mL·min-1。色谱图见图1。

图1 异甘草素各溶液HPLC 图谱 Fig.1 HPLC spectra of isoliquritigenin solution

3.2.4 线性关系考察

分别精密吸取1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，以峰面积为纵坐标Y，进样量为横坐标X (μg)作回归曲线，得异甘草素回归方程：Y=2 108.7 X +4.900 5，R2=0.999 9，线性范围0.004 0～0.080 8 μg。

3.2.5 精密度试验

精密量取异甘草素对照品溶液适量，按3.2.3 节所述色谱条件连续进样6次。结果异甘草素峰面积的RSD 为1.7%，说明仪器的精密度良好。

3.2.6 稳定性试验

取3.2.2 节制备的反萃取液，于 0、1、2、4、8、12、24 h 进样测定。结果异甘草素峰面积的RSD 为1.4%，说明供试样品溶液在制备后的 24 h 内稳定性良好。

3.2.7 重复性试验

按3.2.2 节方法平行制备6 份反萃取液，按3.2.3 节所述色谱条件进样测定，结果异甘草素质量分数RSD 为2.1%，说明该方法的重复性良好。

3.2.8 加样回收率试验 取已测定的同一批反萃取液6 份，每份精密量取10 mL，分别加入异甘草素对照品溶液3.5 mL，按3.2.3 节色谱条件测定，记录峰面积并计算回收率，结果异甘草素的平均加样回收率为105.82%，其RSD为1.9%，说明该方法的准确度较好。

3.2.9 异甘草素含量测定

将3.2.2 节制备的各样品液按3.2.3 节条件进行测定，并按回归方程计算含量。

3.3 萃取方法

量取10 mL 0.2 g·mL-1的甘草超滤液于50 mL 离心管中，再加入等体积的络合萃取剂，加盖将离心管固定在旋转混匀仪上萃取10 h (25 r·min-1)，取出，离心10 min (4 000 r·min-1)，取1 mL 下层萃余液于50 mL 容量瓶中，用70% 乙醇定容至刻度，待测。

3.4 反萃取方法

取5 mL 含异甘草素的络合萃取液与等体积反萃取剂加入50 mL 离心管中，加盖并置于旋转混匀仪上于室温下萃取10 h (25 r·min-1)，取出，离心10 min (4 000 r·min-1)，取1 mL 下层反萃取液于50 mL 容量瓶中，用70% 乙醇定容至刻度，待测。

3.5 络合萃取及反萃取反应式

反应式中HA 代表异甘草素，上划线表示组分处于有机相中。

3.6 萃取率及反萃取率的计算

3.7 络合萃取剂组成研究

3.7.1 不同络合剂对异甘草素萃取效果的影响

以磺化煤油为稀释剂，TRPO、TBP 为络合剂，考察络合剂种类和浓度对甘草超滤液中异甘草素萃取效果的影响，结果见表1。

表1 不同络合剂和磺化煤油组合对异甘草素萃取效果的影响 Table 1 The isoliquiritigenin extraction using different complexing agents and sulfonated kerosene combinations

由表1 可知，不同络合剂和磺化煤油组合对异甘草素萃取效果为：TRPO＞TBP，说明1%TRPO +99%磺化煤油组合对异甘草素萃取率高，先选择TRPO 作为络合剂。

3.7.2 不同稀释剂对异甘草素萃取效果的影响

选择TRPO 作为络合剂，磺化煤油和石油醚分别作为稀释剂，对甘草超滤液中的异甘草素进行萃取，考察稀释剂种类和浓度对异甘草素萃取效果的影响，结果见表2。

表2 不同稀释剂和TRPO 组合对异甘草素萃取效果的影响 Table 2 The isoliquiritigenin extraction using different diluents and TRPO combinations

由表2 结果可知，以0.7% TRPO 作为络合剂时，不同种类的稀释剂对甘草超滤液中异甘草素的萃取效果为：磺化煤油 ＞ 石油醚，说明1% TRPO + 99% 磺化煤油组合对异甘草素萃取率高，故选择磺化煤油作为稀释剂。

3.7.3 不同体积分数TBP 对异甘草素萃取效果的影响

以磺化煤油为稀释剂，以不同体积分数TBP 为络合剂，对甘草超滤液中的异甘草素进行萃取，考察不同体积分数TBP 对异甘草素萃取效果的影响。结果见表3。

表3 不同体积分数TBP 和磺化煤油组合对异甘草素萃取效果的影响 Table 3 The isoliquiritigenin extraction using different volume fraction TBP and sulfonated kerosene combinations

由表3 可知，随着络合剂TBP 体积分数的增加，异甘草素的萃取率也随之增加，当TBP 体积分数增加到15% 时，异甘草素的萃取率达到最高，初步确定15% TBP+85% 磺化煤油作为络合萃取剂。

图2 不同体积分数TRPO 对异甘草素萃取效果的影响 Fig.2 Effect of complex agent volume fraction on the isoliquiritigenin extraction

3.7.4 不同体积分数TRPO对异甘草素萃取效果的影响

以磺化煤油为稀释剂，以不同体积分数TRPO 为络合剂，对甘草超滤液中的异甘草素进行萃取，考察不同体积分数络合剂对异甘草素萃取效果的影响。结果见图2。

由图2可知，随着络合剂TRPO体积分数的增加，异甘草素的萃取率也随之增加，当TRPO 体积分数增加到1% 时，异甘草素的萃取率达到最高，初步确定1% TRPO + 99%磺化煤油作为络合萃取剂。

3.7.5 三元络合萃取剂对异甘草素萃取率的影响

由于二元络合剂的TRPO 价格昂贵，不利于异甘草素的工业制备，出于节省溶剂方面考虑，以异甘草素的萃取率为指标，通过析因实验考察TRPO、TBP 在络合萃取异甘草素时是否具有协同作用，以期构建出更有优势的TRPO+TBP+磺化煤油三元络合萃取体系。

在单因素实验的基础上，将TBP 和TRPO 的浓度确定为析因实验的2 个因素，每个因素取3 个水平，各因素水平平行测定3 次。因素水平表见表4，实验方案和结果见表5，采用SPSS-21 软件对表5 中的数据进行2 因素析因设计的方差分析，结果见表6。

表4 析因实验因素水平表Table 4 Levels of factorial experimental factors

表5 析因实验方案和结果 Table 5 Factorial experimental scheme and results

表6 实验结果的方差分析表Table 6 Variance analysis of experimental results

由以上实验结果可知，当异甘草素萃取率达到99.23% 时萃取剂的组成为0.5% TRPO + 10% TBP + 89.5% 磺化煤油。TBP 的加入可有效减少TRPO 用量，大幅降低萃取剂成本，最终决定选择三元络合萃取体系。

3.7.6 络合萃取后异甘草素收率

精密量取甘草超滤液和三元体系萃余液各40 mL，60 ℃ 水浴浓缩后，在60 ℃ 真空干燥箱中挥成干膏，精密称定两干膏适量，高效液相测定，由此可得40 mL 超滤液干膏中异甘草素量为0.085 9 mg，40 mL 萃余液干膏中异甘草素量为0 mg，络合萃取后异甘草素收率100%。

3.8 反萃取工艺研究

3.8.1 反萃取剂种类对异甘草素萃取效果的影响

为解决萃取剂循环利用和异甘草素产品中有机溶剂残留问题，本文对含有异甘草素的络合萃取剂(萃合物)进行反萃取，用不同种类反萃取剂对3.7 节所得萃合物进行反萃取，反萃取结果见表7。

表7 反萃取剂种类对异甘草素反萃取率的影响 Table 7 Effect of stripping agent type on the extraction rate of isoliquiritigenin

由表7 结果可知，应选择0.012 5 mol·L-1NaOH 水溶液作为异甘草素的反萃剂。

3.8.2 反萃取剂浓度对异甘草素萃取效果的影响

为提高产品纯度、进一步减小反萃取剂用量，本文对反萃取剂浓度进行了进一步考察，结果见表8。

表8 反萃取剂浓度对异甘草素反萃取率的影响 Table 8 Effect of stripping agent concentration on the back extraction rate of isoliquiritigenin

由表8 可知，在NaOH 的浓度为0.010 0 mol·L-1时，异甘草素的反萃取率仍能够达到97.85%。最终选择0.010 0 mol·L-1NaOH 水溶液作为异甘草素的反萃取剂。

3.8.3 反萃取后异甘草素收率

精密量取三元体系反萃取液40 mL，60 ℃水浴浓缩后，在60 ℃ 真空干燥箱中挥成干膏，精密称定干膏适量，高效液相测定，由此可得反萃后的干膏中异甘草素量为0.081 7 mg，反萃取后异甘草素收率为95.11%。

3.8.4 异甘草素总收率

40 mL 超滤液干膏中异甘草素量为0.085 9 mg，反萃后的干膏中异甘草素量为0.081 7 mg，总收率95.11%。

3.9 萃取剂的循环利用对异甘草素萃取效果的影响

为考察萃取剂循环利用对异甘草素萃取效果的影响，按照上述最佳络合萃取和反萃取条件进行3 次萃取剂循环利用的平行试验，测得萃取率均值为98.94%，RSD 为0.6%；反萃取率均值95.49%，RSD 为0.9%；结果显示，本文运用的络合萃取剂能够被循环利用。

4 结 论

本文选用氨水提取异甘草素，氨水的体积分数仅为0.75%，并采用超滤技术对氨水提取液进行浓缩，除去了提取液中悬浮物和可溶性大分子物质，这很好地克服了上述有机溶剂提取异甘草素所具有的缺点。络合萃取是通过被萃取物质和萃取剂两者之间的官能基团发生专属化学反应，生成可溶于萃取剂的新物质(萃合物)来实现分离目的的化学萃取技术。该技术具有从中药稀提取液中萃取含量很低的待分离物质的特点，在甘草超滤液不经浓缩的情况下，高效萃取富集了异甘草素，缩短了工艺流程。此外，萃取剂经反萃取可实现循环使用，可实现低成本、环保、产品无有机溶剂残留。