基于红外光谱指纹图谱的肉桂提取物质量控制

李 宁 李 滢 刘 暘 郭明里 任 超 黄 茜 杨兆祥 张建文*

（1.昆药集团股份有限公司， 云南昆明650100； 2.大理大学， 云南大理671000）

中药肉桂是樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥树皮。肉桂始载于《神农本草经》，列为上品。中医传统认为肉桂具有补火助阳、引火归元、散寒止痛、温通经脉的功效，临床用于阳痿宫冷、腰膝冷痛、肾虚作喘、虚阳上浮、眩晕目赤、心腹冷痛、虚寒吐泻、寒疝腹痛、痛经经闭等证的治疗［1⁃2］。现代研究表明肉桂中主要含有挥发油、二萜及其糖苷、黄烷醇及其多聚体，此外还含有黄酮及其苷类、木脂素及其苷类、简单芳香类、多糖类等多种类型的化合物，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗补体、抗肿瘤、抗菌等药理作用［3］。

肉桂用于预防和治疗病毒感染的研究报道极少。近期美国福克斯健康新闻报道在家养肉桂植物中发现抗病毒活性成分［4］，但未见具体的研究结果。经文献搜索发现以色列特拉维夫大学已在中国知识产权局获得了一个与肉桂提取物抗病毒相关的专利［5］，经仔细分析该专利只对肉桂抗病毒成分的制备和抗病毒结果做了简短描述，没有活性成分的物质基础以及质量控制方法的详细分析。最近有研究报道肉桂的水提物或从肉桂中制备的花青素与多酚类形成的多聚体可以有效的阻断H7N3和HIV 进入细胞从而表现出显著的抗病毒作用［6⁃8］。根据上述信息，课题组制备了肉桂水溶性抗病毒有效部位KPC⁃rg1，该部位为大分子水溶性多酚，且具有糖类结构片段［9］。使用激光束投射实验证明KPC⁃rg1 溶液呈现典型的丁达尔效应，暗示KPC⁃rg1 在溶液中以溶胶态存在。课题组对KPC⁃rg1 抗病毒活性进行系统分析［9］，再次证明该有效部位对多种病毒有显著的抑制活性，而且认为KPC⁃rg1 拥有的抗病毒活性与KPC⁃rg1的胶体性质有关。当KPC⁃rg1 胶体碰上病毒颗粒后会立即与之结合形成非常稳定的超纳米结构，从而阻止病毒侵入细胞，即所谓“原位固化灭活效应”。基于KPC⁃rg1 拥有的这一特殊的病毒灭活机制，课题组认为KPC⁃rg1 不但可用于各类疱疹病毒如带状疱疹病毒和单纯疱疹病毒感染外用治疗性药物的开发，还可以用于感染性极强的包膜类病毒如H1N1和HIV 病毒灭活疫苗制备的探索。

肉桂水溶性抗病毒有效部位的化学成分复杂，研究认为其分子量大于或等于10 kDa［5］。由于分子量大，极性强，溶解度低，缺乏有效的分离手段，至今尚未从中分离得到单体化合物并鉴定结构。目前，肉桂及其制剂的质量评价多以挥发油及其他小分子次生代谢产物（如桂皮醛、肉桂酸） 为化学指标，建立相应的含有量测定及指纹图谱分析方法［2］。这些方法难以满足如KPC⁃rg1 的水溶性有效部位的质量控制要求。由于质量控制方法缺失，难以保证KPC⁃rg1 质量的稳定性及均一性，进而难以保证其安全性及有效性。

近年来，红外光谱指纹图谱在中药指控领域取得了较大进展［10⁃14］。该方法具有自身鲜明的技术特点： 样品前处理简单，基本不使用有毒、有害试剂，分析速度快，操作简单，分析成本低。红外光谱指纹图谱基于分子中官能团振动、转动的能级跃迁，直接反映化学结构，无需化学对照品，能够同时对样品多种成分进行分析表征，反映样品宏观（整体） 化学信息，体现中药作用的整体性和模糊性。

本研究采用中红外光谱技术结合化学计量学分析KPC⁃rg1 的指纹图谱，以期探索符合KPC⁃rg1 特点的质量控制方法。在此基础上，对不同原料、不同制备工艺及不同储存时间的KPC⁃rg1 进行比较分析，以期为KPC⁃rg1 的进一步研究和开发提供参考。

1 材料

肉桂药材于2015 年5 月购自云南昆明螺蛳湾中药材市场，产地云南。锡兰肉桂Cinnamomum zeylanicumBl.于2015 年10 月购于美国，产地斯里兰卡。阴香Cinnamomum burmanni（Nees et T.Nees） Blume 药材于2015 年10 月购自广西玉林中药材市场，产地广西。所有药材经昆药集团股份有限公司李宁博士鉴定为正品，凭证标本存放于昆药集团股份有限公司药物研究院天然产物部。BrukerTensor 27红外光谱仪（德国Bruker 公司）。红外光谱测定压片用KBr为光谱纯。KPC⁃rg1 制备用水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 KPC⁃rg1 制备 参照文献 ［9］，将药材粉碎，过60 目筛，10 倍量水20 ℃浸泡提取3 次，每次2 h。提取液过滤，取滤液，浓缩，加入0.3 mol／L 酸性磷酸盐缓冲液（pH 6.0），以盐酸调pH 至3.0，静置。取沉淀部分，即得。并在此基础上对工艺参数加以调整，样品信息见表1。

2.2 红外光谱测定 红外光谱分析过程中室内温度保持20～25 ℃，空气相对湿度保持30%～40%。将待测样品置于干燥器中24 h 以上，精密称取各待测样品2.0 mg，分别与100 mg 干燥的KBr 混合，于玛瑙研钵中在红外灯下充分研磨，压制成透明薄片，放入红外光谱仪测定。光谱扫描范围4 000～400 cm-1，光谱分辨率4 cm-1，扫描累加次数16 次，重复测定3 次，扫描时扣除H2O 和CO2的干扰。

2.3 光谱处理方法与评价 将红外光谱仪采集的数据（平均图谱） 导入OriginPro 8 软件，经过二阶导数变换，分别绘制红外指纹图谱原始图谱和二阶导数图谱。将OriginPro 8 软件处理过的数据导入Excel 2013 软件，以平均数法分别生成红外指纹图谱原始图谱共有模式和二阶导数图谱共有模式，以相关系数法计算各图谱与相应的共有模式图谱的相似度。将Excel 2013 软件处理过的二阶导数数据导入Simca 13 软件，进行主成分分析。

表1 样品信息

3 结果与讨论

3.1 实验条件考察

3.1.1 样品与KBr 混合比例 分别称取样品1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg 与100 mg KBr 研磨均匀后压片，将制得的供试片置于红外光谱仪中进行测试，结果表明，样品用量为2.0 mg 时，压片效果较好，且红外吸收峰强度较好。

3.1.2 扫描次数 将供试片置于红外光谱仪中，依次调整扫描次数为2、4、8、16、32 进行测试。结果表明，随着扫描次数的增加，谱图的重复性越好，但是测试时间增加。综合各种因素，选择扫描次数为16。

3.1.3 重复测定次数 将供试片置于红外光谱仪中，样品连续扫描2、3、5、8 次得到红外图谱。结果表明，测量次数越多，测得谱图的重复性越好，但样品测试时间越长，综合各种因素，选择样品重复测定次数为3 次。

3.2 方法学考察

3.2.1 精密度试验 取同一批KPC⁃rg1 样品，按“2.2”项下方法制备供试片，并连续测定6 次，对比红外指纹图谱。结果所得谱图的谱线重合，表明仪器精密度良好。

3.2.2 重复性试验 取同一批KPC⁃rg1 样品，按“2.2”项下方法平行制备6 份供试片，分别置于红外光谱仪中测定。结果所得谱图的谱线重合，表明该方法重复性良好。

3.2.3 稳定性试验 取同一批KPC⁃rg1 样品，按“2.2”项下方法制备供试片，置干燥器中保存，分别于0、1、2、3、4、5、8、12、24 h 测定所得红外谱图。结果显示24 h内所得红外图谱的谱线重合，表明样品压片后24 h 内稳定性良好。

3.3 样品检测 按“2.2” 项下实验方法分别对20 批样品进行红外测试，按“2.3” 项下数据分析方法对原始数据进行处理。20 批样品红外原始指纹图谱见图1。KPC⁃rg1 样品红外原始指纹图谱于3 432、1 618、1 523、1 445、1 284、1 105 cm-1等区段有较为明显的特征吸收峰，不同植物来源及不同制备方法得到的提取物指纹图谱大体一致。

图1 20 批样品红外原始指纹图谱

S1～S10 为采用标准制备方法制备的KPC⁃rg1 样品，选取S1～S10 以平均数法生成共有模式见图2，20 批样品以相关系数法计算与共有模式的相似度，计算结果见表2。4 000～400 cm-1范围内红外指纹图谱的相似度均大于0.950，16 批样品高于0.990，表明其总体化学成分具有一定的相似性。S8、S9、S10 以及S14 的相似度低于0.990，表明其化学成分同共有模式有差异。总体而言，红外原始指纹图谱能够对KPC⁃rg1 的化学成分进行快速表征，但指纹图谱的区分度不理想。

图2 样品红外原始指纹图谱共有模式图

表2 20 批样品红外原始指纹图谱相似度

为进一步挖掘红外指纹图谱包含的化学信息，课题组对红外原始图谱进行了二阶导数变换分析。20 批样品的红外二阶导数指纹图谱与共有模式见图3～4，相似度见表3。二阶导数指纹图谱可在一定程度上减少图谱重叠峰的叠加，提高图谱的分辨率，体现更多的结构信息。其中S1～S7 相似度均在0.950 以上，提示其化学一致性较好。S8～S10 的相似度低于0.950，特别是S9，相似度仅为0.768。该3 个样品的制备时间距测试时间较长，经历了约6 个月的储存期。KPC⁃rg1 含有多酚类物质，在放置过程中容易发生结构变化。这一结果表明需进一步深入研究其稳定性并优化储藏条件。S11～S12 为工艺摸索过程中改变提取温度的样品，其相似度高于0.950，提示KPC⁃rg1 的化学成分对考察的提取温度变化不敏感。S13、S14、S16、S17 为工艺摸索过程中改变盐析pH 样品，其相似度远低于正常工艺样品，表明pH 在KPC⁃rg1 制备过程中非常重要。S15 改变了盐析工艺的盐溶液浓度，其相似度大于0.950，提示KPC⁃rg1 的化学成分对考察的盐溶液浓度变化不敏感。S18～S20 为采用锡兰肉桂及阴香制备的KPC⁃rg1 样品，其相似度低于0.350，提示其物质基础同肉桂制备的KPC⁃rg1 样品有较大的差异。二阶导数指纹图谱具有较好的区分度，不但能够对不同植物来源的样品进行区分判别，同时能够反映制备工艺对产品化学成分的影响。

基于20 批样品的红外二阶导数指纹图谱建立主成分分析模型。第一主成分（PC1） 和第二主成分（PC2） 的得分散点图见图5。所有样品大致聚为两类，S1～S12 以及S15 聚为一类，S13、S14 及S16～S20 聚为另一类。S1～S12以及S15 均为采用肉桂药材制备的KPC⁃rg1。同相似度评价结果相似，改变提取温度的样品S11～S12 以及改变盐析工艺盐溶液浓度的样品S15 与采用标准制备工艺的样品S1～S10 聚为一类，提示其化学成分的一致性较好。采用锡兰肉桂及阴香制备的样品S18～S20 与以上样品在得分图上的分布有明显的距离。改变盐析pH 的样品S13、S14、S16 及S17 与标准制备工艺的样品S1～S10 也有明显的区分。

图3 20 批样品红外二阶导数指纹图谱

图4 样品红外二阶导数指纹图谱共有模式图

表3 20 批样品红外二阶导数指纹图谱相似度

剔除S13、S14 及S16～S20 后，对S1～S12 以及S15 共13 批样品再次进行主成分分析。得分散点图见图6。改变提取温度的样品S11～S12 以及改变盐析工艺盐溶液浓度的样品S15 基本落入S1～S7 的范围。储存时间较长的样品S8～S10 分布较为离散。

以上结果表明该主成分分析模型能够反应不同样品的化学结构差异，有良好的鉴别能力。红外二阶导数指纹图谱主成分分析与相似度分析的结果趋向一致，分组结果相同。分析方法不同，其分析的依据与参数均有差异，从不同的角度出发，采用不同的分析方法，得到相同或相近的分析结果，表明2 种方法在分析此类问题上，较为可靠，可用于肉桂提取物的质量评价。

图5 20 批样品红外二阶导数指纹图谱主成分分析得分散点图

图6 13 批样品红外二阶导数指纹图谱主成分分析得分散点图

4 结论

本研究首次采用中红外光谱技术结合化学计量学分析研究KPC⁃rg1 的指纹图谱，以期探索符合KPC⁃rg1 特点的质量控制方法。在此基础上，对不同原料，不同制备工艺及不同储存时间的KPC⁃rg1 进行比较分析。本实验建立的肉桂提取物红外指纹图谱检测方法操作简单，快速，具有良好的精密度、重复性、稳定性，能够反映样品宏观（整体） 化学信息。结合化学计量学分析，不但能够对不同植物来源的样品进行区分判别，同时能够反映制备工艺对产品化学成分的影响。该方法尤其适用于结构复杂、物质基础尚不清晰的复杂体系的质量控制，能够用于肉桂提取物的质量评价并指导进一步的制备工艺参数优化，以期为KPC⁃rg1 的进一步研究和开发提供参考。