基于网络药理学探讨黄芪治疗2型糖尿病有效成分及作用机制

王庆学 吴雍真 李 倩 杜海洋 刘春艳 柴艺汇

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus;T2DM)是由于胰岛素抵抗与胰岛β细胞功能失常导致碳水化合物、蛋白质、脂肪代谢异常，以高血糖为特征的代谢性疾病[1]。据统计，我国糖尿病患者数量位居世界首位，仅在2015年就约有130万人因糖尿病及其并发症死亡，且其中60岁以下占总死亡人数40.8%，呈逐渐低龄化的趋势，并且国际糖尿病联盟预测，到2040年我国将有1.51亿糖尿病患者[2]。现阶段临床上对T2DM的治疗主要为口服传统降糖药、注射胰岛素等为主，虽可一定程度控制病情，但很难从根本上治愈T2DM[3]。因此，对T2DM的防治急需研发出安全高效的新方法。T2DM归属中医“消渴”范畴，与西医相比中医重视辨证论治、内外并重，不仅疗效良好、副作用低，还可有效缓解并发症的发生，提高患者的生活质量。

中药黄芪(Astragali Radix)已有2000多年的药用史，始载于《神农本草经》，为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补气升阳、敛疮生肌、利尿消肿、固表止汗、补益肾气等功效[4-5]。现代药理研究表明，黄芪在免疫调节、抗肿瘤、抗感染、糖尿病、心血管疾病等方面具有重要作用[6]。通过对临床上治疗T2DM有效的中医药方剂进行收集、整理、分析发现黄芪用药频次较高，为治疗T2DM的常用药[7]。研究显示，黄芪甲苷可通过调节糖脂代谢、炎症反应、胰岛素抵抗等方面防治糖尿病[8]，同时临床观察也显示中药黄芪对T2DM的防治显示出良好的疗效[9]。黄芪防治T2DM具有多成分、多靶点等特点，故药效物质基础及作用机制难以明确。

网络药理学可多方位揭示药物治疗疾病的潜在作用机制，涉及多个学科的技术与知识。已有研究表明，利用网络药理学研究中药的作用机制符合中医药整体作用特点，方法准确可靠[10]。鉴于此，本研究利用网络药理学，筛选药物的活性成分及黄芪防治T2DM的潜在靶点，构建“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网络，对靶点进行富集分析，探讨其潜在作用机制，为后续实验验证提供科学依据。

1 方法

1.1 筛选黄芪有效活性成分与T2DM靶蛋白 通过TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库搜集黄芪的化学成分；以口服生物利用度(OB)≥30，药物相似度(DL)≥0.18为标准，筛选黄芪有效活性成分，并查询有效活性成分相对应的靶点。在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)获得T2DM相关靶点。所得化合物的靶点与T2DM靶点取交集，使用Cytoscape v3.7.2软件构建药物-活性成分-靶蛋白-疾病可视化联系。

1.2 构建蛋白-蛋白互作网络 将交集得到靶点导入String数据库(https://string-db.org/)，构建蛋白质-蛋白质(PPI)互作网络。将Degree从大至小排序，以前30为标准筛选核心靶点。

1.3 GO功能富集分析和KEGG富集分析 将1.2筛选出的核心靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov),以人类为研究对象进行GO(gene ontology)注释和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，将P值设为小于0.01。其中GO分析包括生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)。

2 结果

2.1 黄芪有效成分及靶蛋白分析 通过TCMSP数据库检索关键词“黄芪”获得成分87个，通过相关条件筛选得到黄芪有效成分20个(如表1所示)，并查询获得有效活性成分相对应的靶点，剔除4个未查询到靶点的活性成分，结果显示16个活性成分共对应210个靶点。在GeneCards、OMIM数据库检索关键词“Type 2 diabetes mellitus”，筛选得到相应靶点后取并集，删除重复项后获得T2DM相关靶点。将筛选获得的有效活性成分对应的靶点与T2DM相关靶点取交集，获得57个靶点分别对应13个活性成分。Degree排前5的有效活性成分为槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempferol)、异鼠李素(isorhamnetin)、刺芒柄花素(formononetin)、毛蕊异黄酮(Calycosin)，这些可能为黄芪治疗T2DM的关键有效成分(如表2所示)。利用Cytoscape软件建立“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网络(如图1所示)。

表1 TCMSP数据库筛选出黄芪有效成分

表2 关键有效成分

2.2 构建蛋白-蛋白互作网络 将重合的57个靶点导入String作PPI网络，网络共有57个节点，512条边(如图2所示)，根据Degree大小排列，取前30筛选为核心靶点(如图3所示)。将核心靶点对应的有效成分与2.1所得的5个可能为黄芪治疗T2DM的有效成分取交集，结果显示交集与之前5个有效成分相同，故推测，槲皮素、山萘酚、异鼠李素、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮可能是黄芪治疗T2DM的关键有效成分。

2.3 基因功能与通路富集分析 通过DAVID数据库对黄芪治疗T2DM的30个潜在作用的核心靶点进行分析，根据P<0.01，共得到116个GO注释，46条KEGG通路。按P值大小，筛选出前20个GO注释(如图4所示)，表中GO注释12个与BP有关，7个与MF有关，1个与CC有关，GO注释大多与BP和MF相关，如转录因子结合、酶结合、基因表达正调控、RNA聚合酶II启动子对转录的正调控等。

KEGG结果显示，30个核心靶点共富集在46条通路上，主要集中在癌症信号通路、乙型肝炎、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、病毒性心肌炎、低氧诱导因子(HIF-1)信号通路、人嗜T淋巴细胞病毒I型感染、军团菌病、p53信号通路、催乳素信号通路、雌激素信号通路等。P值排前20条通路(如图5所示)。

3 讨论

3.1 黄芪发挥作用的关键有效成分 近年来，众多实验及临床观察均证实黄芪对T2DM具有良好的疗效，但对其有效成分与机制尚不明确。本研究利用网络药理学，构建“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网络，结果显示黄芪13个活性成分对应T2DM的57个靶点，并通过分析获得黄芪治疗T2DM的关键活性成分可能为槲皮素、山萘酚、异鼠李素、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮，其中，作用最强的两个化合物均被报道有明显降糖作用。槲皮素又名槲皮黄素，属于黄酮类化合物，广泛存在于植物的果实、花和叶中，具有调节血脂和血糖和清除氧自由基、抗肿瘤、抗炎等作用[11]。研究显示，槲皮素可降低T2DM模型大鼠血糖，并有效减轻其外周胰岛素抵抗，并且槲皮素也可改善被高糖抑制的神经细胞增殖活性，减少氧化应激损伤[12]。山奈酚又名百蕊草素Ⅲ，属于黄酮类化合物，具有调节免疫、抗病毒、抗氧化等功效。近年研究表明山奈酚在T2DM及并发症的防治中具有很大的应用前景。山奈酚具有保护胰岛β细胞功能、改善胰岛素抵抗、调节血糖血脂的作用，并且对T2DM的并发症也具有保护作用[13]。其余三个关键活性成分与T2DM相关报道较少，故推测这几种活性成分与T2DM的研究较少，本研究可为后期深入探讨黄芪治疗T2DM的有效成分提供理论参考。

3.2 黄芪治疗op的核心靶点 对黄芪治疗T2DM所涉及的57个靶点进行PPI网络的构建并分析，结果显示Degree排前30的靶点(图3)为血管内皮生长因子A(VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP)3、白介素-6(IL-6)、表皮生长因子受体(EGFR)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)等，并推测这些靶点可能在黄芪治疗T2DM中发挥关键作用。VEGF为内皮细胞特异性有丝分裂原，具有强大的促血管形成能力和促血管通透效应，对维持微循环系统功能正常有重要作用，而VEGFA则被认为是传统意义上的VEGF。糖尿病状态下，糖基化终末产物及各种细胞因子的增多、蛋白激酶C的活化等因素均可导致肾脏VEGF的表达升高[14]。在对T2DM全基因组关联研究发现VEGFA基因上的单核苷酸多态性位点rs9369425与T2DM存在相关性[15]。IL-6是一种多功能细胞因子，在免疫、炎症中起关键调节作用。T2DM患者长期处于低度炎症的状态下，IL-6多存在异常升高。研究显示，黄芪多糖可调节T2DM大鼠IL-6水平，保护胰岛β细胞，改善机体糖代谢状态[16]。MAPK信号转导通路是哺乳动物细胞内介导细胞反应的重要信号系统，普遍存在于多种生物。MAPK与T2DM关系密切，MAPK的激活可促进外周胰岛素抵抗，抑制胰岛素的合成与分泌，增加胰岛细胞的凋亡。

3.3 主要富集通路 GO功能富集分析结果显示，黄芪可能在转录因子结合、酶结合、基因表达正调控、RNA聚合酶II启动子对转录的正调控等过程中起作用，发挥起防治T2DM的功效。KEGG通路富集分析结果显示黄芪可能调控癌症信号通路、乙型肝炎、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、病毒性心肌炎、低氧诱导因子(HIF-1)信号通路、人嗜T淋巴细胞病毒I型感染、军团菌病、p53信号通路、催乳素信号通路、雌激素信号通路等防治T2DM。这些通路都较为复杂，包括多个下游通路。例如显著性最高的癌症信号通路包括、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路等[17]。PPAR是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，具有多种生物学效应。研究显示，PPAR在T2DM中具有重要作用，其可增强机体对胰岛素的敏感性、调节体内糖代谢平衡等[18]。Wnt信号通路是调控器官生长和分化的重要通路之一，与肿瘤的发生发展相关。Wnt信号通路在糖尿病发生发展中的作用已受到广泛关注，也有研究证实，Wnt信号通路多个组成成分参与胰岛β细胞的增殖、葡萄糖诱导的胰岛素分泌等[19]。MAPK是一组细胞内广泛分布的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其可磷酸化靶蛋白来调控信号通路，抑制肝脏对糖的输出、降低脂肪生成和三酰甘油合成，从而发挥能量代谢功能。并且MAPK可通过上调葡萄糖转运载体-4的表达，促进糖的吸收与利用，增加胰岛素敏感性和改善胰岛素抵抗[20]。此外，雌激素、TNF与胰岛素具有密切关系，雌激素可影响胰岛素敏感性，并且其水平降低可减弱雌激素抑制TNF释放的作用，TNF-α抑制脂肪、肌肉细胞胰岛素受体在胰岛素刺激后自体硫酸化能力，并显著降低葡萄糖转运蛋白的表达[21]。

综上所述，本研究初步验证和预测黄芪治疗T2DM的有效成分与分子机制，发现结果呈现多成分、多靶点、多通路的特性，可为后续深入研究其具体机制提供思路和基础。