HPLC法同时测定益肺清解汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸的含量

王 晖 刘 敏 刘 磊 李 雪*

1.徐州医科大学附属医院药学部，江苏 徐州 221006;2.徐州医科大学，江苏 徐州 221004

益肺清解汤为我院自制制剂，委托江苏省颐海药业股份有限公司生产灌装。处方根据江苏省中医药管理局印发的《江苏省新型冠状病毒感染的肺炎中医辩证方案(试行第一版)》的预防处方，由黄芪、苏叶、防风、金银花、薄荷、麦冬、甘草七味药制得，功效为益气养阴、扶正祛邪。主要用于我院医护人员预防新型冠状病毒使用，可提高人体正气，抵御外邪。由于处方中黄芪为君药，具有补气升阳、固表止汗之功效，金银花作为臣药，具有清热解毒、疏散风热之功效[1]，两药为方中起主要作用的成分。本实验通过查阅文献和反复摸索，建立了HPLC同时测定益肺清解汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸的含量。该实验方法易于操作，专属性、重复性和精密度均较好，测定结果可靠，可用于我院该自制剂的质量控制。

1 仪器和材料

1.1 仪器 美国Waters高效液相色谱仪(含1525型二元高效液相色谱泵、717型自动进样器、2847型双波长紫外吸收检测器和Empower色谱数据处理工作站)；日本岛津UV-2401PC型紫外分光光度计；上海精密科学仪器公司 FA1004B型电子天平、雷磁pHS-3B型精密pH计。

1.2 试药与试剂 益肺清解汤样品来自本院制剂室(江苏省颐海药业股份有限公司生产灌装)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号：120225，纯度≥98%)、绿原酸(批号：wkq07050201，纯度≥98%)均购自四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈、甲酸为色谱纯、水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱采用Waters公司Xterra®RP18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)。流动相：乙腈(流动相A)-0.1%甲酸(流动相B)按照下面表1中程序进行梯度洗脱。流速为1.2 mL·min-1，检测波长为320 nm，柱温30 ℃，进样量为20 μL。在上述条件下，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸峰形良好，两种成分色谱峰的理论塔板数均大于10000，与干扰峰的分离度均大于2.5，保留时间分别约为13.3 min、10.2 min。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别用电子天平精密称量毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品11.57 mg、绿原酸对照品20.89 mg，置同一10 mL容量瓶中，加入50%的乙腈水溶液溶解，并滴定至刻度，摇匀，制得混合对照品储备溶液(每1 mL中含毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.157 mg、绿原酸2.089 mg)，再精密量取上述对照品储备溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%的乙腈水溶液，滴定至刻度(每1 mL溶液中含有毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.1157 mg、绿原酸0.2089 mg)，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取益肺清解汤合剂5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加入50%乙腈水溶液，滴定至刻度，摇匀，用滤纸滤过，续滤液再用0.45 μm微孔滤膜进行过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性供试品溶液的制备 按益肺清解汤处方制备缺少黄芪、金银花药材的阴性样品，依照“2.2.2”项下方法进行处理，即得。

2.3 结果

2.3.1 专属性试验 在上述2.1的色谱条件下，分别取2.2中制得的供试品溶液、混合对照品溶液和阴性供试品溶液3种溶液适量，分别装入高效液相色谱仪进样20 μL，记录色谱图，结果如图1所示。结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸均分离较好，无干扰，说明该实验建立的系统对成分的检测专属性较好。

2.3.2 线性关系试验 精密吸取2.2.1项下的混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用50%的乙腈水溶液稀释滴定至刻度，摇匀，即得。各种浓度的对照品溶液分别重复进样3次，记录峰面积。以所含标准品进样量X(μg)作横坐标，峰面积积分平均值(Y)作作纵坐标，计算并进行线性回归，实验得到结果：毛蕊异黄酮葡萄糖苷：Y=5860.32X+14.78，r=0.9999；绿原酸：Y=2816.7X+10.20，r=0.9998；表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量在0.023～0.463 μg，绿原酸进样量在0.042～0.836 μg线性关系良好，符合定量要求。

2.3.3 检测限和定量限 取2.2.1项下的混合对照品溶液适量，分别等倍逐级稀释进样测定3次，记录峰面积。当信噪比为3∶1，计算测得检测限分别为：毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.58 ng、绿原酸0.81 ng；当信噪比为10:1时，得定量限分别为：毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.80 ng、绿原酸2.75 ng。

2.3.4 稳定性试验 取经2.2.1项方法制备的益肺清解汤(批号：2002101)供试品溶液，按照2.1项下的色谱条件进行进样试验，分别在0、2、4、8、16、24、48 h进样测定。结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸两种成分，按色谱峰面积计算所得的RSD分别为0.32%和0.75%，说明供试品溶液在48 h内室温保存，溶液质量稳定。

2.3.5 回收率试验 精密称取已知含量的一批益肺清解汤溶液(批号：20120210)9份，分别精密加入2.2.1项下制备的低、中、高3种不同浓度(相当于供试品溶液浓度的80%、100%、120%)的混合对照品溶液，再按2.2.2项下的方法制备供试品溶液，每个浓度的样品制备3份，按照2.1项下的色谱条件进样分析计算回收率，结果见表2。

表2 回收率实验结果 (n=9)

2.3.6 精密度试验 精密取经2.2.1项方法制备的标准品溶液10 μL，按照2.1项下的色谱条件连续进样6次，对峰面积进行分析计算。计算结果显示毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸峰面积的RSD分别为0.25%、0.24%，结果表明使用该系统测量的精密度良好。

2.3.7 重复性试验 精密称取一批益肺清解汤溶液样品(批号：2002101)6份，每份1.0 mL。按2.2.2项下的方法制备供试品溶液，制得的样品按照2.1项下的色谱条件进样分析计算，结果显示每1 mL样品中含毛蕊异黄酮葡萄糖苷40.95 μg，RSD为0.25%；含绿原酸109.05 mg，RSD=0.38%，结果表明使用该系统测量的重复性良好。

2.3.8 样品测定 取样品5批次(批号分别为2002101、2002102、2002103、2002111、2002112)，分别按2.2.1项下的方法制备供试品溶液，并按照2.1项下的色谱条件进样分析计算，结果益肺清解汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸的含量(按质量分数计)结果见表3。

表3 供试品含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 检测成分的选择 黄芪、金银花为处方中的主要药效药材，目前现行标准中尚无对其同时进行含量测定。药典中黄芪以黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷为指标性成分进行含量测定，金银花以绿原酸进行为指标性成分进行含量测定，而黄芪甲苷因无紫外吸收，因此本实验选取方中的有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸进行定量测定分析研究；单独对两种定量分析已有相关报道[2-3]，本实验采用一测多评法同时测定2个成分含量，更能有效控制该自制制剂的质量。

3.2 分离条件的选择 实验参考文献采用了多种方法进行成分分离[4-6]：乙腈-水梯度洗脱；乙腈-0.1%冰醋酸梯度；甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脱等。结果发现，以甲醇为有机流动相出峰时间较长且峰较宽，分离度较差；而如果水中不加入酸调节流动性pH值的情况下绿原酸的色谱峰难以洗脱检测出来。最后采用乙腈-0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱，所测的两种成分与干扰成分得到较好的分离，保留时间也合适，峰形达到HPLC定量的要求。

3.3 检测波长的选择 利用紫外分光光度计对毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸进行吸收光谱扫描，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在259 nm和320 nm有吸收峰，绿原酸在327 nm有最大吸收峰，结合色谱图并参考2015版《中华人民共和国药典》及相关文献中报道[7-9]，本实验采用320 nm作为测定波长，两种成分均能获得较好的信号响应。

4 小结

本实验中采用高效液相的方法对益肺清解汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸进行同时测定，对色谱条件进行了多次实验，实现了同一色谱条件下的分离和含量测定。该方法操作简单，且精密度、重复性和回收率均符合中国药典中高效液相定量的要求，为同时测定中药成方合剂中多成分的研究提供一定的参考，并可作为我院该自制制剂的质量标准。