白车轴草中总黄酮提取工艺研究

王军捷 麦康明 温雪儿

摘要：基于超声波提取法探究提取白车轴草（Trifolium repens）中黄酮类物质的最佳工艺条件。以芦丁为空白对照，总黄酮得率为考察指标，通过亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法，采用单因素试验及L9（33）正交试验设计，研究超声时间、乙醇浓度和液固比3种因素对白车轴草中黄酮类物质提取率的影响。结果表明，白车轴草总黄酮提取的最佳工艺条件为超声提取时间40 min、乙醇浓度50%、液固比60∶1（mL∶g）。在此条件下，白车轴草中总黄酮的提取率为2.853%。该试验设计方法高效、快速、经济，适用于白车轴草总黄酮提取工艺研究，并为白车轴草有效提取黄酮类物质提供试验依据。

关键词：白车轴草（Trifolium repens）;总黄酮;正交试验;提取工艺

Abstract： Based on the ultrasonic extraction method， the optimal technological conditions for extracting flavonoids from Trifolium repens was explored. With rutin as a blank control， the total flavonoid yield rate was an inspection index， and the effect of three factors， which were ultrasonic time， ethanol concentration and liquid-solid ratio， on the extraction rate of flavonoids in Trifolium repens was studied by the sodium nitrite-aluminum-sodium hydroxide method， single-factor test and L9（33） orthogonal test design. The results demonstrated that the optimal extraction process conditions of total flavonoids from Trifolium repens were ultrasonic time 40 min， ethanol concentration 50%， liquid-solid ratio of 60∶1（mL∶g）. Under these conditions， the extraction rate of total flavonoids in Trifolium repens was 2.853%.  The test design method was highly efficient， fast and economical. It was suitable for the research on the extraction process of total flavonoids from Trifolium repens and provided experimental basis for the effective extraction of flavonoids from Trifolium repens.

Key words： Trifolium repens; total flavonoids; orthogonal test; extraction process

白車轴草（Trifolium repens）系豆科车轴草属（Trifolium）多年生草本植物，又名白花苜蓿、三消草、螃蟹花、金花草、菽草翘摇[1]，其株高10～40 cm，茎匍匐，无毛，三出复叶，具长柄、小叶倒卵形，边缘具细锯齿，托叶椭圆形，抱茎。车轴草类植物主要含有异黄酮类、三萜皂苷类、黄酮类以及芳香挥发性类成分，具有清热凉血、祛痰止咳、镇静止痛的功效[2]。此外，白车轴草可作为防治土壤荒漠化和水土流失的良种，其能改善生态环境，在“退耕还草”中起着重要作用。现有研究表明，黄酮类化合物具有消除疲劳、保护血管、预防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、活化大脑及其他脏器细胞的功能，其药理作用表现为抗炎镇痛、抗病毒、抗辐射、抗癌抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗心脑血管疾病等[3-7]，具有较高的药用价值。

近年来，从植物中提取黄酮类物质已成为天然药物研究的热点，但目前关于从白车轴草中提取黄酮类物质的研究却鲜有报道。因此为了有效地开发和利用车轴草属植物资源，高效地从白车轴草中提取黄酮类物质，本研究以白车轴草为试验材料，采用单因素试验和正交试验相结合的方法从白车轴草中提取黄酮类物质，对白车轴草中黄酮类物质的提取工艺进行优化，以期为更好地开发白车轴草提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和材料

KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司），WFJ-7200型可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限责任公司]，BS223S电子精密天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），HH-S数显恒温水浴锅（金坛市正基仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱PH-030（A）（上海大欣科学仪器有限公司）。

白车轴草（采自西南科技大学），芦丁（中国药品生物制品检定所），乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝均为分析纯，试验用水为去离子水。

1.2 总黄酮测定方法

1.2.1 材料预处理 将采摘的白车轴草清洗干净，置于40 ℃的烘箱中干燥到一定程度（湿重631.57 g，干重84.42 g，干湿重比值0.134），粉碎，过60目筛，备用。

1.2.2 对照品溶液的制备 准确称取芦丁标准试剂0.01 g，置于50 mL的容量瓶中，加入适量70%的乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，静置，得到浓度为0.20 mg/mL的芦丁标准溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 准确称取白车轴草粉末2.0 g，置于锥形瓶中，往其中加入一定浓度的乙醇溶液超声提取，提取完成后，冷却，过滤，取滤液，即得。

1.2.4 标准曲线的绘制 采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法绘制标准曲线。准确吸取0.20 mg/mL芦丁标准溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分别置于10 mL的容量瓶中，加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，静置6 min;再加入10%的硝酸铝溶液0.3 mL，静置6 min;继续加入5%的氢氧化钠溶液4 mL，加去离子水定容，摇匀，放置15 min，以不加芦丁标准溶液的空白组为对照，于510 nm波长处测定吸光度值。以芦丁标准溶液浓度为横坐标，吸光度值A为纵坐标，获得标准曲线的方程为A=11.071C-0.001 3，R2=0.997 4。由图1可知，芦丁标准品在 0.004～0.020 mg/mL浓度范围内呈良好线性关系，吸光度值与浓度符合朗伯-比尔定律。

1.3 白车轴草总黄酮的测定

按“1.2.4”的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定总黄酮浓度，按下式计算总黄酮得率：

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声提取时间对总黄酮得率的影响 在设定液固比为30∶1（mL∶g，下同）、乙醇浓度为60%的基础上，研究不同超声提取时间20、30、40、50、60 min对总黄酮得率的影响及变化规律。由图2可知，当20 min≤超声提取时间≤30 min时，随超声提取时间延长总黄酮得率逐渐增大，并在超声提取时间为30 min时总黄酮得率达到最大;当超声提取时间>30 min时，总黄酮得率随超声提取时间延长而逐渐下降至趋于平缓。

2.1.2 乙醇浓度对总黄酮得率的影响 在设定液固比为30∶1、超声提取时间为40 min的基础上，研究不同乙醇浓度40%、50%、60%、70%、80%对总黄酮得率的影响及变化规律。由图3可知，当40%≤乙醇浓度≤50%时，总黄酮得率随着乙醇浓度升高而不断增大，并在乙醇浓度为50%时总黄酮得率达到最大;当乙醇浓度>50%时，随着乙醇浓度升高，总黄酮得率逐渐减小。

2.1.3 液固比对总黄酮得率的影响 在设定乙醇浓度为60%、超声提取时间为40 min的基础上，研究不同液固比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1对总黄酮得率的影响及变化规律。由图4可知，当20∶1≤液固比<50∶1时，随液固比增大，总黄酮得率先减小后明显增大，并在液固比为50∶1时达到最大。当50∶1≤液固比≤60∶1时，总黄酮得率随液固比增大而减小。

2.2 正交试验

为确定最佳提取条件，需全面考虑超声提取法的工艺参数，根据单因素试验的结果及有关资料，以总黄酮得率为考察指标，将超声提取时间、液固比、乙醇浓度3因素3水平进行正交试验，选取L9（33）正交试验设计[7]，得到提取白车轴草总黄酮的最佳工艺条件，试验设计见表1，正交试验结果分析见表2，方差分析见表3。

由表2可知，各因素對试验结果影响不同，极差R大小顺序为A > C > B，即超声提取时间>液固比>乙醇浓度，A因素（超声时间）对总黄酮得率影响最大，B（乙醇浓度）对总黄酮得率影响最小。从k值得出，白车轴草总黄酮得率最高水平组合方案为A3B1C3，即超声提取时间40 min，乙醇浓度50%，液固比60∶1（mL∶g）。在此因素水平下白车轴草总黄酮得率最高，为2.853%。由表3可知，因素A、B、C对总黄酮得率的影响均达到显著水平（P<0.05），对总黄酮得率影响的主次顺序为A > C > B，即超声提取时间>液固比>乙醇浓度，与直观分析结果一致。

3 小结与讨论

在一定的乙醇浓度范围内，白轴草内的黄酮类物质的溶出速度随着乙醇浓度升高而增加，乙醇浓度达50%时溶出速度达到平衡。随着乙醇浓度继续升高，一些醇溶性杂质、色素和亲脂性强的成分溶出量增加，从而影响黄酮类物质的溶出速度[8]。因此，为达到黄酮的最高溶出速度，白车轴草总黄酮提取的最佳乙醇浓度为50%。

当超声提取时间过短时，黄酮类物质还未充分溶出，超声提取时间达30 min时黄酮类物质的溶出速度达到最大。继续延长超声提取时间，对黄酮结构有所破坏[9]，或超声提取时间过长溶剂挥发，导致乙醇浓度降低和部分总黄酮降解[10]，从而使总黄酮得率减小。同时基于节约时间的角度考虑，因此白车轴草总黄酮的最佳超声提取时间为30 min。

在一定的液固比范围内，白车轴草内的黄酮类物质的溶出速度随着液固比增大而增大，液固比为50∶1（mL∶g）时溶出速度达到最大。由于已经浸出的黄酮对未浸出的黄酮有协同浸提作用，液固比继续增大不利于协同浸提，且会使白车轴草内的其它杂质溶出，从而影响总黄酮得率。同时考虑到液固比过大将给后续的浓缩等操作带来不便，因此白车轴草总黄酮提取的最佳液固比为50∶1（mL∶g）。

正交试验结果表明，3种因素对白车轴草总黄酮提取的影响主次顺序为超声时间>液固比>乙醇浓度。白车轴草总黄酮提取的最佳工艺条件为超声提取时间40 min、乙醇浓度50%、液固比60∶1（mL∶g），在此条件下白车轴草总黄酮得率为2.853%。本研究探讨了白车轴草总黄酮的提取工艺，通过正交设计选出最佳工艺条件，为白车轴草有效提取黄酮类物质提供了试验依据。

参考文献：

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[8] 王飞飞. 重楼茎叶总黄酮的提取纯化工艺及抗氧化活性研究[J]. 安徽农业科学，2019，47（9）：164-167.

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