喉癌患者癌组织中lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1水平及预后关系

李斐， 常昆鹏， 张炜

郑州大学附属洛阳中心医院耳鼻咽喉科(河南洛阳 471003)

喉癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤，发病率逐年上升，具有病死率高、预后差等特点[1]。喉癌的发病因素复杂，由多种内、外源性致癌因素共同作用所致。研究表明，喉癌的发生、发展是一个多阶段、多基因参与的复杂过程[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度>200个核苷酸的非编码RNA，能通过多种机制参与疾病或肿瘤的发生。生长组织特异性转录体5(growth attest-specific transcript 5，lncRNA GAS5)在肿瘤的发展进程中发挥重要作用，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移并促进细胞凋亡等。研究显示，lncRNA GAS5在多种肿瘤中表达下调，且低表达患者预后较差，发挥抑癌基因的作用[3]。肺癌转移相关转录本1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1)是一个高度保守的lncRNA，主要在核内表达。lncRNA MALAT1在多种组织内表达，在肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生理活动中起重要作用，且在细胞G1/S期及有丝分裂过程中起调控作用[4]。研究发现，lncRNA MALAT1在非小细胞肺癌组织中表达上调，其表达水平与患者预后有关[5]。lncRNA GAS5和lncRNA MALAT1在多种肿瘤疾病中发挥作用，但二者在喉癌中的表达及作用鲜少有报道。因此，本研究将通过检测喉癌中lncRNA GAS5和lncRNA MALAT1的表达情况，分析二者的表达与喉癌患者预后的关系，为喉癌的诊断及治疗提供支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年11月至2014年2月在本院进行手术切除的63例喉癌患者作为研究对象，其中男49例，女14例；年龄39～74岁，平均(56.24±7.85)岁。将切除的癌组织作为观察组，同时取同一患者的癌旁(距肿瘤边缘>2 cm)组织作为对照组(镜检未发现癌细胞)。按照喉癌TNM分期标准[6]：其中Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期35例。按照病理学分级：其中低分化29例，中高分化34例。

纳入标准：(1)初发喉癌患者；(2)术前未进行放疗或化疗者；(3)临床病理资料完整者；(4)患者及家属知情且同意。

排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)合并患有肝、肾、心脏等疾病者；(3)自身免疫疾病者。

收集患者的临床资料并进行为期5年的随访，随访的开始日期为手术日期，截止日期到2019年3月1日。

1.2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(货号：12183025)及反转录试剂盒(货号：KR116)，均购自于北京天根生化有限公司；qRT-PCR试剂盒(货号：204141)，购自德国QIAGEN公司；实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：LightCyler 480)，购自德国Roche公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集 收集手术切除的喉癌组织，同时采集距肿瘤边缘2 cm以外的癌旁组织，将样本置于-80℃冰箱备用。

1.3.2 qRT-PCR测定lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表达量 从-80℃取出样本，提取总RNA：将样本超声匀浆，严格按照RNA提取试剂盒说明书操作，检测RNA纯度及其完整度；逆转录反应：将所得RNA用反转录试剂盒反转录为cDNA，严格按照说明书进行操作，产物置于-20℃冰箱保存备用。qRT-PCR反应：反应体系20 μL，10 μL 2×SYBR Mix，cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，H2O 6 μL，每个样本做3次平行，反应条件为95℃反应30 s；95℃反应15 s、60℃反应30 s，40个循环；72℃延伸10 min，在qPCR仪上进行反应。lncRNA GAS5的上游引物为：5′-CTTCTGGGCTCAACTGATCCT-3′，下游引物为：5′-TTGTGCCATGAGACTCCATCAG-3′；lncRNA MALAT1的上游引物为：5′-GGATCGTCTCCCCACAAGCC-3′，下游引物为：5′-GGTCTGTGCCTCGATCAAAAGGCA-3′；二者均以GAPDH为内参，上游引物为：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，下游引物为：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。使用ΔΔCt 法对结果进行相对定量分析，根据各样本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法计算lncRNA GAS5和lncRNA MALAT1的相对表达量。

2 结果

2.1 测定组织中lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表达量 观察组lncRNA GAS5的表达量明显低于对照组(P<0.05)，lncRNA MALAT1的表达量则明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组 lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表达情况比较

2.2 喉癌患者lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1表达与临床病理特征的关系 根据观察组lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1表达水平的中位值分别将其分为两组，其中lncRNA GAS5高表达26例，低表达37例；lncRNA MALAT1高表达35例，低表达28例。喉癌患者癌组织中lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表达水平与年龄、肿瘤部位及淋巴结是否转移无关(P>0.05)；lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表达水平与TNM分期、肿瘤的分化程度有关(P<0.05)。见表2。

表2 喉癌患者lncRNA H19、SIRT6表达与临床病理特征的关系 例

2.3 影响喉癌患者预后的因素分析 单因素分析显示，lncRNA MALAT1表达、TNM分期及肿瘤分化程度均是影响喉癌患者预后的危险因素，lncRNA GAS5表达是影响喉癌患者预后的独立保护因素。多因素分析显示，lncRNA MALAT1表达是影响喉癌患者预后的独立危险因素(HR=1.90，95%CI为1.27～2.84，P<0.05)，lncRNA GAS5表达是影响喉癌患者预后的独立保护因素(HR=0.79，95%CI为0.65～0.97，P<0.05)。见表3。

表3 影响喉癌患者预后的因素分析

2.4 喉癌组织lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表达与患者预后的关系 分别绘制喉癌患者术后1～60个月lncRNA GAS5高、低表达者及lncRNA MALAT1高、低表达者的生存曲线。lncRNA GAS5高表达者及低表达者术后5年的总生存率分别为76.92%(20/26)、51.35%(19/37)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。lncRNA MALAT1高表达者及低表达者术后5年的总生存率分别为51.43%(18/35)、75.00%(21/28)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 喉癌患者癌组织lncRNA GAS5表达5年生存曲线

图2 喉癌患者癌组织lncRNA MALAT1表达5年生存曲线

3 讨论

喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，侵袭度相对较高，其主要的发病因素包括不良生活习惯、外界环境和遗传因素等。近年来，随着环境污染加剧、人口老龄化和吸烟率居高不下，喉癌发病率呈上升趋势，且预后状况不容乐观[7]。目前，对于早期喉癌的治疗可以通过手术及放疗辅助达到预期；但喉癌具有隐蔽性，发现时多为中晚期，治疗效果不佳，术后患者的生活将受到极大的影响。因此，在分子水平上寻求高效的诊断及治疗标志物，对喉癌患者的生存质量有重大意义。

LncRNA大多具有高度保守的二级、三级结构，能够在生物学过程中发挥重要作用。大量研究表明，lncRNA能够在染色体剂量补偿、基因组印记、功能性蛋白质转运等过程中发挥重要作用[8]。尽管lncRNA不能编码蛋白，但参与机体的生理活动，如细胞周期调控、转录前与转录后调控、表观遗传学修饰及免疫应答等，且在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。研究发现，lncRNA H19在喉癌组织中表达下调，可能具有抑癌作用[9]；lncRNA HOTAIR在喉癌患者中表达上调，且表达越高，患者生存率越低，可能具有致癌作用[10]。

lncRNA GAS5最初在鼠NIH3T3纤维原细胞中被发现，在人体内位于1q25.1处，含12个外显子，其在组织中广泛表达，但表达水平差异较大。研究显示，lncRNA GAS5在多种肿瘤组织中表达下调，发挥抑癌作用；过表达能抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，诱导细胞凋亡[11]。Li等[12]研究发现，lncRNA GAS5在乳腺癌组织中低表达，在体外培养的细胞株中过表达后可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。Shi等[13]研究表明，lncRNA GAS5在非小细胞肺癌组织中低表达，肿瘤越大、TNM分期越高，其表达水平越低。本研究检测喉癌组织中lncRNA GAS5的表达水平，发现观察组lncRNA GAS5的表达显著低于对照组，提示lncRNA GAS5可能参与喉癌的发生发展；喉癌患者癌组织中lncRNA GAS5的表达与TNM分期、肿瘤的分化程度有关；分析影响喉癌患者的预后因素，发现lncRNA GAS5表达是影响喉癌患者预后的独立保护因素，提示上调lncRNA GAS5的表达可能会抑制喉癌的发展进程；喉癌患者术后5年的生存状况分析表明，lncRNA GAS5高表达患者的总生存率明显高于低表达患者，提示lncRNA GAS5低表达对喉癌患者的预后起不良效果。

lncRNA MALAT1最初在非小细胞肺癌转移过程中被发现，位于人染色体11q13.1处，来自单个外显子。lncRNA MALAT1可影响多种蛋白质在核内的定位，并参与染色体重排、组蛋白修饰、小RNA构建等过程，从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[14-15]。李子博等[16]研究表明，lncRNA MALAT1在乳腺癌组织中表达上调，其高表达与乳腺癌的浸润转移相关，在乳腺癌中具有一定的诊断价值。孙敏等[17]研究发现，lncRNA MALAT1在宫颈癌组织中表达上调，lncRNA MALAT1表达与宫颈癌患者的预后有关，高表达患者的术后生存率低于低表达患者。本研究检测喉癌组织中lncRNA MALAT1的表达水平，发现观察组lncRNA MALAT1的表达显著高于对照组，提示lncRNA MALAT1可能参与喉癌的发生发展；喉癌患者癌组织中lncRNA MALAT1的表达与TNM分期、肿瘤的分化程度有关；分析影响喉癌患者的预后因素，发现lncRNA MALAT1表达是影响喉癌患者预后的独立危险因素，提示下调lncRNA MALAT1的表达可能会抑制喉癌的发展进程；喉癌患者术后5年的生存状况分析表明，lncRNA MALAT1高表达患者的总生存率明显低于低表达患者，提示lncRNA MALAT1高表达对喉癌患者的预后起不良效果。

综上所述，在喉癌患者癌组织中lncRNA GAS5表达下调，lncRNA MALAT1表达上调，二者均与TNM分期、肿瘤的分化程度有关，与喉癌患者的预后密切相关，提示二者可作为预测喉癌预后的特异指标，为喉癌的预后治疗起到帮助。但本研究未对lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1在喉癌中的作用机制进行探讨，下一步将会着重探索二者在喉癌发生发展过程中的作用机制，以期为喉癌的诊断及治疗提供依据。