循环内皮细胞、内皮细胞微粒检测对不完全川崎病的辅助诊断价值*

蔡泽波， 于力， 韦明， 李燕芳

1深圳市福田区妇幼保健院儿科(广东深圳 518000)； 2广州市第一人民医院儿科(广东广州 510180)

小儿川崎病(Kawasaki disease，KD)即皮肤黏膜淋巴结综合征，是儿童常见的以发热为主要症状并累及全身中小血管的免疫性出疹性疾病[1]。临床表现典型的KD患者根据其症状和体征即可明确诊断，且能够得到积极有效治疗，预后良好。但是不完全川崎病(incomplete Kawasaki disease，IKD)由于症状及体征不典型，有时仅仅以发热为主要表现，或伴部分炎症相关指标升高，抗感染效果不理想，往往拟“发热查因”进行一系列辅助检查后仍难以明确诊断，容易耽误病情[2-3]。IKD患者发病机制与机体免疫紊乱相关，在疾病早期已存在全身系统性中小血管炎，通过检测细胞因子及相关炎症指标，特别是当前国内外研究比较多的肿瘤坏死因子-α及白细胞介素族等往往会有异常改变，但是均无特异度[4-5]。目前国内外有少量研究发现，在部分血管炎患者中检测循环内皮细胞(circulating endothelial cells，CECs)和内皮细胞微粒(endothelial microparticles，EMPs)结果升高，考虑与原发疾病引起的血管内膜损伤有关[6]。故本文主要研究CECs、EMPs在IKD疾病早期是否存在变化，探讨CECs、EMPs检测对IKD辅助诊断的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年9月至2019年8月本院儿科收治住院的IKD患者12例作为IKD 组，典型川崎病(文中称川崎病)患儿12例作为 KD 组，另外选择同期发热≥5 d的急性上呼吸道感染患儿12例作为对照组。其中IKD组男5例，女7例，年龄在7个月至7岁2个月之间，平均(3.9±1.8)岁；KD组男7例，女5例，年龄在8个月至8岁2个月之间，平均年龄(4.3±2.1)岁；对照组男、女均为6例，年龄在6个月至7岁9个月之间，平均(4.1±1.9)岁。3组研究对象性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本次研究获得医院医学伦理委员会批准，患者监护人均对本次研究知情且自愿参与(年长儿童同时征求个人意见后参与)。充分告知研究具体事宜及风险后，监护人愿意签署知情同意书。

1.2 纳入标准 IKD组及KD组符合第8版《诸福棠实用儿科学》IKD及川崎病诊断标准[7]，对照组符合急性上呼吸道感染诊断标准且发热时间≥5 d；所有研究对象3个月内未使用大剂量激素、大剂量非甾体类抗炎药、人免疫球蛋白、免疫抑制剂及化疗药物，既往无风湿免疫性疾病、过敏性紫癜等疾病及心肺脑严重基础病。

1.3 治疗方法 IKD组及KD组参照第8版《诸福棠实用儿科学》川崎病治疗方法[7]，在确诊或临床诊断后，给予首次人免疫球蛋白2 g/kg静脉治疗，并给予阿司匹林、双嘧达莫口服治疗，合并肺炎支原体或细菌感染时给予相应的抗生素治疗。

1.4 实验方法 (1)对所有研究对象均在入组后(均处于急性期，其中IKD组及KD组为静脉注射人免疫球蛋白前)，均抽取外周静脉血3 mL，注入抗凝管后静置15 min，于冰箱-20°C保存，检测CECs、EMPs。具体测定方法：①CECs计数采用免疫磁珠分离方法，试剂及分析仪由Beckman Coulter,Inc.提供；②EMPs检测采用流式细胞术，试剂及分析仪同样由Beckman Coulter,Inc.提供。以上操作由项目组成员经过Beckman Coulter,Inc.区域检验技师培训后严格操作。(2)IKD组及KD组在急性期行心脏彩色多普勒检查，测量双侧冠状动脉内径，判断是否存在冠状动脉病变(coronary artery lesions，CALs)。仪器为日本东芝Aplio500彩色多普勒超声诊断仪，由超声科医师操作，严格记录结果。CALs判断标准参考第8版《诸福棠实用儿科学》川崎病章节[7]，主要评估冠状动脉内径改变(狭窄、轻度扩张、中度扩张、巨型冠状动脉瘤等)。

1.5 评价指标 总结临床资料，比较3组之间CECs、EMPs水平差异，比较IKD组与KD组急性期CALs发生率，计算CECs、EMPs在IKD急性期的诊断试验综合评价指标。

2 结果

2.1 各组CECs、EMPs检测结果比较 急性期IKD组和KD组外周血CECs、EMPs水平显著高于对照组，差异有统计学意义(t=6.91、3.93，6.32、4.11,P<0.05)；IKD组与KD组之间CECs、EMPs比较，差异无统计学意义(t=0.39、0.78,P>0.05)。见表1。

表1 3组CECs、EMPs检测结果比较

2.2 IKD组与KD组急性期出现冠状动脉病变情况对比 急性期IKD组出现CALs 4例，占比33.3%(4/12)；KD组出现CALs 3例，占比25%(3/12)；IKD组与KD组出现CALs发生率比较，差异无统计学意义(2=1.321，P=0.252)。

2.3 CECs、EMPs检测对IKD的诊断价值分析 本文IKD组、对照组病例全部纳入“不完全川崎病疑似病例”研究组，先通过绘制ROC曲线获取CECs最佳截断点3.97个/μL，EMPs最佳截断点0.89×103/μL，CECs、EMPs检测结果高于或等于各自最佳截断点时标记为阳性，小于最佳截断点时标记为阴性。CECs、EMPs单一检测及联合检测(系列诊断试验)结果见表2，诊断价值分析见表3。

表2 IKD组与对照组CECs、EMPs单一及联合检测结果 例

表3 CECs、EMPs单一及联合检测对IKD的诊断价值分析

3 讨论

川崎病是儿童时期常见的自身免疫性血管炎性疾病，好发于婴幼儿及5岁以内的学龄前儿童，其常见的临床表现为发热5 d以上，并伴有全身皮肤不规则/多形性皮疹、四肢末端皮肤变化、球结膜非渗出性充血、唇充血皲裂伴口腔黏膜弥漫性充血、颈部淋巴结非化脓性肿大等改变[1]。对于发热5 d以上儿童患者，如果难以找到局部病灶及具体病原学依据，且又缺乏典型的川崎病表现时，则应重点考虑IKD可能[8-9]。近些年国内外对IKD的病例报道增多，其中国外学者Dayasiri等[10]报道指出IKD发病率占全部川崎病患者中的13.8%～26.2%，说明IKD有较高的发病率。临床上发现，IKD患者除了临床表现不典型外，其发病早期多数患者尚未累及心脏，此时超声检查仅有少部分患者能够发现冠状动脉病变或大血管内膜改变，故临床诊断难度大，容易漏诊及误诊[11]。

多项研究表明，IKD的发病机制与川崎病发病机制一致，均为感染或非感染因素诱发的机体免疫紊乱，体内超抗原及细胞因子活跃，引起血管内皮损伤，血管内皮细胞脱落增多，出现全身性非特异性中小血管炎[12-14]。当机体受到外界的创伤、应激或机体免疫紊乱并出现血管炎时，可加快血管内皮细胞代谢、凋亡；不管生理性或病理性因素影响，血管内皮细胞脱落后，便进入血液循环，即称为CECs[15-16]。其次，血管内皮细胞在代谢、凋亡过程中会释放很多直径<1 μm的微小囊泡，即EMPs[17]。其实目前EMPs产生机制不明，但是当患者机体血管炎强烈、或血管内皮损伤越重时，血管内皮细胞脱落增多，CECs相应增加，同时血管内皮细胞及CECs释放的EMPs也增多。EMPs在机体循环中参与了促炎症反应及促凝血作用，其增多时可加重血管内皮细胞损伤及出现内皮细胞功能障碍[18-19]。另外，有资料提到过敏性紫癜与川崎病的病理变化有一定共同点，均存在系统性血管炎[20]。国内学者付书琴等[21]曾在过敏性紫癜患者中研究EMPs水平，发现作为血管内皮细胞损伤的标志物，EMPs在过敏性紫癜患者中水平升高，特别是累及肾脏血管时，血管内皮细胞损伤加重，EMPs水平更高。所以，CECs及EMPs与机体血管炎密切相关，在外周血中检测CECs及EMPs水平，可能对机体血管炎的评估具有重要作用。

现本次研究主要通过检测IKD组、KD组、对照组患者外周血CECs、EMPs水平，评估机体血管炎状态，探讨CECs、EMPs在IKD早期诊断的作用。实验结果分析如下：(1)急性期IKD组和KD组CECs、EMPs显著高于对照组急性上呼吸道感染患者，而IKD组与KD组之间比较，CECs、EMPs无明显差异，说明IKD患者在疾病早期已经出现血管内皮细胞损伤，机体已存在血管炎，其血管炎状态与川崎病患者一致，而发热≥5 d的急性上呼吸道感染患者并未出现血管炎。国内学者周雅娟等[22]曾报道在川崎病急性期CECs水平升高，有利于川崎病的早期诊断；王从军等[23]也曾报道过川崎病患者急性期EMPs水平越高，机体血管炎及冠状动脉病变可能越严重。本研究结果与周雅娟、王从军等学者在川崎病患者中检测CECs、EMPs报道的结果一致，说明外周血CECs、EMPs的检测有利于IKD疾病早期与以发热为主要症状的非血管炎患者的鉴别。(2)通过心脏彩超检查，急性期IKD组CALs发生率33.4%，KD组CALs发生率25%，IKD组出现CALs比例高于KD组，但两组率的比较差异无统计学意义。该实验结果与杨洁等[24]研究的IKD及川崎病患者发生CALs的实验结果一致，说明IKD疾病早期部分患者已存在冠状动脉损害，但是33.3%的CALs检出率提示IKD的早期诊断不能过多依赖心脏彩超检查。(3)通过诊断试验综合评价CECs、EMPs对IKD早期诊断的价值，其中单一检测CECs或EMPs时均能获得良好的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及Youden指数，其次将CECs、EMPs联合检测时，采用系列诊断试验，也能够获得较高的敏感度、特异度及阳性预测值、阴性预测值等。故结果说明不管CECs、EMPs是单一检测还是联合检测，其对IKD的诊断及IKD与发热查因患者的鉴别诊断均有一定意义。

综上所述,CECs、EMPs检测可能能够有效评估机体血管炎的状态，对辅助IKD的早期诊断及识别有重要作用。但是由于本次研究收集的IKD样本量较小，后续将继续收集IKD样本，进一步确定CECs、EMPs在评估机体血管炎方面的价值。