多穗柯提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选*

方海莲，刘妹玲，李诗瑶，肖竹平

(吉首大学民族药解析与创制湖南省工程实验室，湖南 吉首 416000)

糖尿病是一种常见的代谢性内分泌疾病，因为胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致，其中95%以上为2型糖尿病[1-2].糖尿病是目前医治成本最高、负担最重的慢性病之一，并且可引发多种并发症，如糖尿病肾病、糖尿病足、糖尿病酮症酸中毒、糖尿病视网膜病变等[3-4].国际糖尿病联盟(IDF)最新发布的数据显示，目前全球有4.63亿人患有糖尿病，预计到2030年，糖尿病患者总数将增至5.78亿[5].α-葡萄糖苷酶是一类主要分布于小肠粘膜刷状缘上、能断裂非还原末端的α-葡萄糖苷键、水解食物中二糖及多糖的常见酶.通过抑制α-葡萄糖苷水解酶的作用，能有效减少或抑制糖类的水解，延缓糖类的吸收，从而降低血糖浓度[6-7].目前临床治疗糖尿病的方法几乎都是利用药物来降低血糖含量.如二甲双胍、磺酰脲类、阿卡波糖等药物，虽然控制血糖的效果很好，但是往往不能治疗由糖尿病引发的各种并发症，而且这类药物通常会有严重的副作用，长期服用会对患者的机体造成一定的损害及耐药性[8-11].作为另一种选择，已有越来越多的专业人士在探索利用天然产物来预防和治疗糖尿病.天然产物虽然见效慢，但由于是多种成分的组合，各成分的作用机制不同，存在协同增效作用，往往能取得良好的治疗效果，因此，许多专家通过不同的实验筛选出了降糖活性较好的中药[12].

多穗柯(LithocarpuspolystachyusRehd.)，别名胖稠、甜味茶等，壳斗科柯属常绿乔木，药食同源植物，在我国主产于江西、广西及湖南等省，兼具茶、糖、药3种功能，民间俗称“甜茶”.其嫩叶具有甜味，属高甜度、低热能的天然甜味剂[13].数百年来，“甜茶”一直被用作治疗多种疾病的传统中草药[14]，以叶入药，具有清热利尿、滋润肝肾、润肺镇咳等功效，可用于防治温热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽恶疮等症，同时还具有“三抗”(抗氧化、抗过敏、抗癌变)、“三降”(降血压、降血糖、降血脂)作用[15-19].在本研究中，笔者采用不同溶剂(二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、水)提取法和不同溶剂(乙酸乙酯、正丁醇、水层)萃取法得到多穗柯提取物，并分别测定提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，筛选出具有最佳抑制效果的活性提取物，以便为后期降糖药物的研制提供参考.

1 实验材料与仪器

1.1 材料与试剂

材料：多穗柯叶，采集于湖南省邵阳市.试剂：石油醚(沸程60～90 ℃)，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，正丁醇，二甲双胍，购于国药集团；α-葡萄糖苷酶(G5003-100UN Sigma公司)，对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，Sigma公司)，对硝基苯酚(PNP，Macklin公司)，阿卡波糖(Acarbose，拜耳公司)，无水碳酸钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾.所有试剂均为分析纯.蒸馏水自制.

1.2 仪器设备

KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HHSⅡ-2型电热恒温水浴锅(北京长安科学仪器厂)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；Hidolph Hei-VAP Value旋转蒸发仪(德国海道夫集团)；电子天平ME204E(梅特勒-托利多仪器有限公司)；DHG-9240A立式电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)；万能粉碎机(德清拜杰电器有限公司)；Spectra Max Plus 384酶标仪(美国美谷分子仪器有限公司)；高速台式离心机；索氏提取器.

2 实验方法

2.1 多穗柯叶的预处理

多穗柯叶去除杂质和枝杆，晒干，用恒温干燥箱60 ℃干燥4 h，再用粉碎机粉碎，过50目筛备用.在圆底烧瓶中用石油醚按料液比1∶10(g∶mL)90 ℃回流提取2 h，冷却抽滤.滤液经旋转蒸发仪浓缩回收石油醚，残渣干燥称重，得预处理样品用于活性成分的提取.

2.2 多穗柯提取物的制备

取多穗柯预处理样品2份各50 g，分别用溶剂提取法和萃取法制备提取物.一份按液料比1∶10 (g∶mL)的配比依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、蒸馏水提取，在80 ℃恒温水浴锅中各回流提取2次，每次2 h，趁热抽滤，合并相同溶剂滤液，浓缩分别得到二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇提取物、蒸馏水提取物.另一份用70%乙醇提取后，用旋转蒸发仪浓缩回收乙醇，然后依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得到乙酸乙酯层、正丁醇层萃取物和水层提取物.

2.3 提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

采用PNPG法进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测定[20].将所得的活性物质用0.2 mol/L PBS(pH值6.8)溶解，置于4 ℃冰箱中备用.活性检测在96孔板上进行.实验组加25 μL样品液和25 μL α-葡萄糖苷酶(0.2 U/mL)，对照组用等体积的PBS代替样品液，背景组用等体积的PBS代替α-葡萄糖苷酶溶液，空白组加50 μL PBS.在37 ℃恒温箱下培养15 min后，每孔加50 μL PNPG底物(2 mmol/L)，再在37 ℃恒温箱下培养20 min，每孔加100 μL 浓度为0.2 mol/L 的Na2CO3终止反应并显色，在酶标仪405 nm处测OD值(A)，抑制活性用半抑制浓度IC50表示.抑制率I按如下公式计算：

3 结果与分析

3.1 不同提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

测定不同质量浓度提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性，以提取物质量浓度为横坐标、抑制率为纵坐标制作抑制率曲线.以阿卡波糖(Acarbose)为阳性对照，如图1所示，在一定范围内，抑制活性与质量浓度呈正比例关系，但随着质量浓度超过一定范围，抑制率变化较小并趋于稳定.阿卡波糖(Acarbose)对照组IC50为25.26 mg/L，甲醇(MeOH)提取物IC50为34.30 mg/L，与阳性对照组最为相近，抑制效果较好，适于获取抑制活性物质.二氯甲烷(DCM)提取物抑制效果最差.

图1 不同极性提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线Fig. 1 Inhibition Rate Curve of Different Polar Extracts Against α-Glucosidase

3.2 不同萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

将70%乙醇溶液提取得到的总活性成分依次采用不同极性溶剂进行萃取，分离活性部位，然后以阿卡波糖(Acarbose)为阳性对照，测定不同质量浓度萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性.实验结果如图2所示.根据实验数据可以得出，正丁醇(NBA)萃取物、乙酸乙酯(ETAC)萃取物、水层(Water)都有不同程度的抑制活性，其中正丁醇(NBA)萃取物IC50为30.47 mg/L，抑制效果最接近阿卡波糖(Acarbose)的IC50，适于获取用以抑制α-葡萄糖苷酶的活性物质.

图2 不同极性萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线Fig. 2 Inhibition Rate Curve of Different Polar Extract Liquor Against α-Glucosidase

4 结论

使用不同的方法制备了多穗柯提取物(萃取物)，并比较了提取物(萃取物)对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，发现高极性溶剂提取物(萃取物)的抑制活性较好，说明高极性溶剂提取物(萃取物)是α-葡萄糖苷酶的抑制活性部位.笔者初步筛选出抑制α-葡萄糖苷酶的多穗柯活性成分，甲醇提取物(IC50=34.30 mg/L)和正丁醇萃取物(IC50=30.47 mg/L)抑制效果更接近于阿卡波糖(IC50=25.26 mg/L)，为进一步研究多穗柯提取物(萃取物)的降糖活性及其机制奠定基础.