葡萄无核形成与调控机制研究进展

靳月琴，常 丽，王晓芳，韩 冰，纪 薇

（1.山西省蚕业科学研究院，山西运城044000；2.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；3.辽宁省蚕业科学研究所，辽宁凤城118100）

葡萄是公认的最古老的水果之一，也是世界上栽培面积最大、产量最多的水果，在我国栽培广泛，是重要的经济作物。无核葡萄作为鲜食葡萄和制干葡萄市场的重要组成部分，对促进葡萄产业发展有着重要的作用，广受消费者青睐，其主要来源于单性结实型（Parthenocarpy）和假单性结实型（Stenospermacarpy）[1]。

葡萄天然无核品种较少，且现有无核品种品质和商品性相对有核品种较差，不能满足消费者对无核葡萄的需求，因此，无核葡萄品种培育及有核葡萄无核化成为葡萄研究的热点。一方面，单性结实不进行受精作用即可产生种子，但很难应用于无核葡萄新品种选育[2]，所以，目前葡萄无核研究主要集中在种子败育结实型（假单性结实型）葡萄，其虽未能通过授粉受精形成完整种子，但无核及其他优良性状可遗传给后代，遗传性较为稳定，易于葡萄育种及优质栽培[3]。另一方面，一些栽培广泛、品质较佳且商品性强的有核葡萄品种无核化也是无核葡萄的重要来源。

无核葡萄品种是用来了解无核机制的重要基础材料，但是天然的无核葡萄品种较为稀缺，而且我国无核葡萄品种大部分来自国外，严重制约了我国葡萄无核化的发展，其也成为了我国自主培育无核品种的瓶颈[4]；而且有核品种无核化也需要无核形成机制作为理论依据，但是目前国内外对葡萄无核的形成机制尚不明晰，一定程度上阻碍了葡萄无核化技术的进步，加之，我国葡萄无核化技术研究起步较晚，导致我国葡萄优质高效栽培配套技术体系难以形成，致使我国葡萄无核化研究滞后于其他国家。

笔者通过整理总结前人对无核葡萄的相关研究，概述了葡萄无核形成原因及调控机理，为葡萄无核深入研究提供方向，以期促进我国无核葡萄产业的发展。

1 无核葡萄材料

1.1 常见的无核葡萄品种

目前，我国无核葡萄的栽植面积、品种选育在世界上处于快速发展阶段，但我国自己培育的无核葡萄品种较少，大多来源于欧美（美国、法国、意大利、德国和西班牙等）、澳洲及亚洲部分国家（日本、以色列等）（表1）。其中，美国、法国、意大利、日本、加拿大等研究及栽培历史较为悠久[5]，美国无核葡萄培育技术领先于世界水平，品种较为丰富，在世界无核葡萄市场中占据重要地位，如绿宝石无核（Emerald Seedless）、无核白鸡心（Centennial Seedless）、克瑞森无核（Crimson Seedless）、火焰无核（Flame Seedless）和甜蜜东方蓝宝石（Sweet Oriental Sapphire Seedless）等。我国无核葡萄品种选育工作虽起步晚，但发展较为迅速，成果较为显著，如无核翠宝、京早晶、郑果大无核、紫甜无核、金田皇家无核和月光无核等品种[6]，丰富了我国无核葡萄资源，为葡萄无核研究提供了重要保障。

表1常见的国内外选育的无核品种

1.2 无核化处理的有核葡萄品种

通过技术手段将有核品种无核化处理从而获得无核品种也是无核葡萄的重要来源途径。无核化技术在国内外葡萄生产上应用广泛，且涌现出了部分适宜无核化处理的优良品种（表2），如巨峰、阳光玫瑰、醉金香、辽峰、红地球、魏可、红富士等。虽然栽培区域广而且配套技术成熟，但是也存在穗轴硬化、果皮涩味重、大小粒现象严重、商品性不稳定等问题[7]，因此，研究葡萄无核形成机制及掌握品种特性，对葡萄无核调控的意义重大，在一定程度上可以保证无核性状的稳定性，推动葡萄无核产业的健康发展。

表2常见的无核化处理的有核葡萄品种

2 无核形成机制研究

2.1 生理机制

种子是评判葡萄无核性状的直观指标，授粉受精是种子形成的主要途径，一般会形成两类果实：（1）授粉受精正常形成有核果实；（2）授粉受精受阻形成无核果实。其中后者是葡萄无核研究的核心，其形成较为复杂[8]。有生命力的花粉是葡萄植株进行正常授粉受精形成种子的必要保障，花粉来源于雄蕊，其发育异常会导致雄性不育，进而形成无核果实。种子的形成与雌性器官的正常发育也息息相关，胚囊与胚乳是雌性器官的关键组成部分，二者发育异常会导致雌性不育，无法形成正常的种子[9]。正常的授粉受精后，如若胚中途败育，种子也无法形成，其（胚败育）导致的无核是目前的研究热点。

花粉是授粉受精的重要组成部分，其败育或退化是雄性不育研究的关键。真正意义上的无核是不经授粉受精就可以形成果实的雄性不育品种，单性结实是培育无核品种的重要途径，同时其外部形态及营养激素水平与正常状态的差异是研究者的关注重点。牛立新等[10]、李鸿莉等[11]通过扫描电镜对雄性不育葡萄的花粉形态进行了观察，均发现不育花粉的雄蕊花丝短，花药反卷，形状为近球形，没有萌发沟。花粉的萌发离不开营养物质和激素调控，刘倩[12]对葡萄雄性不育品种魏可实生和巨峰实生的花粉观察发现，它们不同发育时期的脯氨酸、可溶性蛋白质和可溶性糖含量不足，与雄蕊发育异常有关，并导致最终败育。郑焕[13]对花药发育不同时期的激素测定表明，钟山红花药内源激素比例失调与葡萄雄性不育有一定的关系[13]。自交不亲和性也是无核形成的重大原因之一，有研究表明，若花粉发育异常，即使落到柱头上，也无法正常受精，这种自交不亲和性受复等位基因控制。

授粉受精是胚形成的基础，受精卵在胚囊内发育成胚，受精的极核发育成胚乳。如黑色柯林斯、黑珍珠等葡萄品种胚囊内的卵细胞与助细胞退化成其他细胞，极核与精子不融合且逐渐退化，无法产生种子[14]。无核白与火焰无核败育机制相似，内珠被、珠孔和胚囊组织形态上发生异常，影响了花粉管向胚珠内的伸长，导致受精率下降[15]。胚发育所需的营养物质是由胚乳提供的，胚乳败育会导致胚的败育[16]。王飞等[17]研究发现，在不同无核葡萄品种胚乳与胚的生长发育中，胚乳败育或退化是引起胚败育的关键因素，胚乳败育，细胞解体消失，随后胚会生长停止，发生败育[18]。

种子败育型葡萄品种是目前主要的无核葡萄育种材料，其胚败育的生理生化研究主要集中在胚珠的营养代谢物质、保护酶活性、膜质过氧化物质、内源激素及游离态多胺等方面。其中，激素是影响种子生长发育的主要因素，葡萄授粉受精或结实后，其体内的激素种类及含量的变化对核形成至关重要。大多数研究表明[5-9]，单一激素（主要是赤霉素）及各类激素协调是诱导葡萄无核果实形成的重要机理。种子形成的不同阶段对激素种类及水平要求不一，不同阶段应用不同浓度或不同种类的激素，会影响果实及种子中激素水平，致使激素失衡，影响胚正常发育，最终形成无核果实。由于地区和品种不同，造成葡萄胚败育过程中内含营养物质动态变化研究有差异，部分研究发现，可溶性糖与可溶性蛋白质含量降低，可溶性淀粉含量变化不大[17-19]。也有研究发现，可溶性糖含量偏高、淀粉及可溶性蛋白质含量偏低[20]。大部分研究认为，无核葡萄胚败育时，保护酶活性下降[17-19]，而董姝娟等[21]研究发现，金星无核的保护酶活性呈现升高趋势，说明不同品种保护酶活性有差异。MDA是膜质过氧化的最终分解产物，一定程度上反映植物膜脂过氧化水平。纪薇等[22]研究表明，胚败育时，丙二醛含量呈上升趋势。江淑平[23]和李桂荣[24]的研究均认为，无核葡萄胚发育过程中激素间的平衡失调，对其后期胚败育有一定的影响，表明胚胎发育与内源激素的调控紧密相关。潘学军等[25]研究认为，胚胎发育过程中，多胺含量较低并急剧下降是胚败育的重要原因。综上可知，葡萄无核研究机制在生理学方面取得了一定的进展，为进一步研究奠定了理论基础，但是由于技术局限，在微观领域相关研究进展缓慢。

2.2 分子生物学机制

葡萄无核现象已被广泛关注，近年来研究方向主要集中在无核性状遗传与无核分子生物学方面。

2.2.1 无核性状遗传 为了了解无核性状的遗传规律，研究者们进行了大量的研究，先后提出了多种假设（表3），各假说在不同时空均能一定程度上解释一些现象，但存在一定的局限性，不能从本质上揭示葡萄无核性状的遗传规律，因此，其遗传规律仍需继续深入研究。

表3葡萄无核性状的遗传规律假说

2.2.2 无核分子生物学研究 无核基因作为无核形成机制研究的关键部分，一直是研究热点。有研究表明，叶绿体伴侣蛋白ch-Cpn21基因和钙结合蛋白基因VvCBP1与种子发育相关[26-27]。MADS-box基因在植物花器官和果实发育过程中有重要的作用，D类MADS-box基因家族的VvAGL11基因在种子败育过程中起非常重要的作用[28]。E类MADSbox基因家族成员VviSEP2在有核葡萄花、花蕾中以及胚珠发育各时期的相对表达水平均高于无核[29]。假单性结实葡萄胚珠败育符合细胞程序性死亡现象，液泡加工酶（VPE）是启动和执行细胞程序性死亡的关键因子，其中，β型VPE是种子特异表达和发育所必须的基因[30]，实时荧光定量PCR分析VPE基因家族在有核、无核葡萄胚珠发育过程中的表达，发现βVPE在后期差别很大，表明其与无核葡萄胚珠败育相关[3]。葡萄ABCG亚家族半分子成员参与植物体脂质的运输和花粉壁的发育，在胚珠败育关键时期，VvABCG20在黑比诺和无核白葡萄中的相对表达水平出现差异，VvABCG6、VvABCG11.1、VvABCG15.4和VvABCG11.8在无核品种中的表达量远高于有核，可能与胚珠败育相关[31]。细胞自噬是蛋白降解的重要途径之一，参与植物生长发育，Vv ATG基因在无核葡萄胚珠发育过程中表达水平较高，表明在无核葡萄中自噬相关活动比较活跃，其可能与无核白胚珠败育相关[32]。YABBY基因家族成员是种子植物特有的转录调控因子，根据YABBY基因在有核无核品种中胚珠发育时期的表达分析来看，VvYABBY4在胚珠败育的关键时期表达差异更为明显，表明其在无核葡萄形成过程中有重要作用[33]。雄性不育品种是生产优质无核葡萄的重要途径之一，不育品种钟山红中，VvMYB4在四分体时期表达量达到了顶峰，随后在单核期迅速降低，到二核期和花粉成熟期表达量极低或基本不表达，由此推测该基因异常表达与苯丙氨酸代谢途径中的关键酶C4H抑制有关[13]。

近年，植物基因组、转录组、代谢组及表型组技术发展迅速，应用广泛。NWAFOR等[34]在发育关键时期对有核葡萄及其芽变品种进行转录组高通量测序，获得了与无核葡萄败育相关的编码PISTILLATA蛋白和MADS-box转录因子。与有核品种相比，无核品种胚珠中VvMADS28转录水平低，VvMADS39的转录水平高，在番茄上进行异源表达后，前者使番茄种子变小，后者使其种子败育，表明二者与种子发育有关[35]。ZHANG等[36]借助SLAF-seq技术和全基因组关联作图研究了葡萄无核性状遗传机理，发现了与无核性状显著相关的294个SNP位点。CAROLINA等[37]通过基因组精准测序后发现，无核葡萄中VviAGL11的氨基酸第197的位置由精氨酸变成了亮氨酸，推测无核的产生是由VviAGL11编码的氨基酸替换引起的。综合可知，葡萄无核研究主要集中在生理和分子生物学研究2个方面，二者相互联系，如GA主要通过抑制VvSRL1的表达来上调VvmiR159c的表达水平，VvmiR159c对GA的应答可能通过VvGAMYB的裂解，进一步诱导葡萄单性结实，最终形成无核果实的调控机制（图1）。

3 技术应用

3.1 葡萄无核化调控

胚胎败育是无核葡萄形成的重要途径之一，胚生长发育过程中对激素较为敏感，因此，生长调节剂的使用成为获得无核果实的重要技术手段。有核葡萄经生长调节剂处理后，致使花器受精不完全，造成败育，不能形成种子，获得无核葡萄。目前使用的生长调节剂主要有赤霉素（GA3）、吡效隆（CPPU）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）等，其中赤霉素应用最早，也最广泛。有核葡萄花期前后用赤霉素等药剂处理花序，部分胚珠在授粉受精后开始败育，出现异常的胚乳核、卵细胞，并且胚囊结构降解[38]。GA3是目前无核化普遍使用的生长调节剂，众多研究认为，其可以阻碍胚（胚囊和胚珠）和花粉正常发育，导致胚囊、花粉发育异常，致使授粉受精不良，形成无核果实，其机理研究基本趋于成熟[39]。目前，生产上已成功利用GA3诱导多个有核品种无核化。阳光玫瑰葡萄是目前研究较热的有核优良品种，王莎等[7]对其研究发现，单独使用GA3处理效果不佳，易造成穗轴卷曲、硬梗或发生药害等，需要与其他生长调节剂搭配使用，要注意搭配种类、使用时期、使用浓度及次数，避免造成药害。对外源GA3处理前后的葡萄进行转录组测序发现，影响葡萄无核的除了赤霉素外，还包括生长素以及其他激素间的交互作用[40]。在无核果实形成过程中，VvIAA9和VvARF7的相对表达量下调，VvDELLA、VvGH3.2和VvGH3.3相对表达量上调[41]。GA-DELLA（SLR1）-VvmiR159c-VvGAMYB在葡萄中是1个很关键的信号调控模型，该模型在外源赤霉素诱导葡萄单性结实机理方面有重要的调节作用[42]。GA处理后在开花后第四周，VvLEC1表达水平明显上调，说明VvLEC1在种子发育中起重要作用[43]。由此可知，无核调控取得了一定的成效，但也存在一定的局限性，研究面较为狭窄，生长调控网络尚不明晰，还需深入研究。

3.2 葡萄无核品种培育

无核品种培育一般采用杂交和芽变等育种方法，但周期长、效率低，耗时耗力。胚挽救技术有效缩短了育种年限，也拓宽了葡萄无核品种育种的范围和效率，是当前无核育种的重要技术方法。随着技术的不断进步，分子生物学技术也广泛应用于葡萄无核品种培育中，进一步加速了品种选育进程。

胚挽救技术由RAMMING等于1982年创立，是一项应用植物组培技术对单性结实（假单性结实）或种子发育异常的受精胚或胚珠，在胚未败育前对其进行挽救创造新种质[44]。目前，国外通过此项技术已获得众多无核品种，如克瑞森无核、红宝石无核、火焰无核和白鸡心等[4]。我国葡萄胚挽救技术应用始于20世纪90年代，以西北农林科技大学为首的一批科研单位先后建立了杂交组合及自交的胚挽救技术体系和结合倍性育种的胚挽救技术体系，为我国无核葡萄品种选育开拓了新渠道，自主培育出秦红无核、秦翠无核、秦红一号、无核早红、沪培1号、沪培2号等无核品种[6]，一定程度上促进了我国无核葡萄的选育进程。

分子标记可以直接对基因型进行选择，加快了筛选速度，明显提高了育种效率。目前常用的有SCAR标记、RAPD标记、SSR标记等。国外无核分子标记的研究方面，LAHOGUE等[45]通过以无核葡萄胚挽救群体为材料，获得了2个与无核主效基因I紧密连锁的RAPD标记。MEJIA[46]也发现了1个SCAR分子标记SCF27。MEJIA等[47]找到了1个新的与葡萄无核性状连锁的SSR标记VvAGLII。国内方面，王跃进等[48]开发了1个约590 bp的SCAR标记。后续人们又继续开发了GSLP1569、39970524-5-564、39970524-6-1538和39970524-6-12004等特异性标记[49]。季晨飞等[50]结合SSR技术对葡萄雄性不育基因进行定位研究和生物信息学分析，初步定位了葡萄雄性不育基因VvMs1。AKKURT等[51]利用葡萄有核品种与无核品种杂交，应用无核基因VMC7f2、SSC8和SCF27对F1进行分子标记早期选育，选出13株与标记相关的无核候选植株。无核分子标记的开发，很大程度上加速了无核葡萄新种质的选育，提高了无核育种的效率。

4 展望

通过归纳总结前人对葡萄无核形成与调控的机制研究，理清了无核性状研究进展，弄清了无核果实的来源及类型，但是对于葡萄无核形成机制尚不明确，以至于无核调控存在一定的局限性。主要集中在无核形成原因复杂多样，调控网络尚未完全掌握，关键调控基因及通路尚不明晰；果实无核调控技术虽然成熟，但是缺乏稳定性及高效性，且方法单一，综合调控技术缺乏，导致效率低、质量差。因此，从分子层面揭示生长调节剂调控的无核化是未来研究葡萄无核机制的重要方向，也是培育无核葡萄品种的重要手段之一。今后应结合多种手段深入研究，利用系统生物学和功能基因组学，更系统深入的探索葡萄无核性状的形成机制与种质创制，为无核机制的探究以及无核技术的开发提供帮助，最终促进我国葡萄无核产业的发展。