血浆Septin9甲基化检测在结直肠癌中的诊断价值

陈 培，邓钦木，李丹丹

（重庆医科大学附属第二医院检验科, 重庆 400010）

根据2017 全球癌症数据库，结直肠癌在恶性肿瘤中的发病率和死亡率分别为第四位和第二位[1]。2018年我国结直肠癌的新发病例数为52.15 万人，因结直肠癌死亡患者4.79 万人[2],并随着经济的发展和居民生活方式的西方化在不断增加[3-4]。研究数据表明，如果每年对居民定期筛查，可以避免结直肠癌中60%的死亡，并且其五年生存率可以从46%提高至73%[5]。因此，结直肠癌标志物的精准检测对临床治疗、预后评估具有重要意义。

目前，结直肠癌的常见筛查方法为Septin9 甲基化（methylated Septin 9，mSEPT9)检测、大便隐血试验（fecal occult blood test, FOBT）、癌胚蛋白（carcino embryonic antigen, CEA）检测以及肠镜检查。其中FOBT 和CEA 的敏感度和特异度较低，在结直肠癌的早期筛查中应用价值有限[6]，肠镜作为结直肠癌诊断的金标准，其特异度高，但是早期诊断不够敏感，并且因其侵入性操作以及肿瘤异质性而应用有限。近年来，液体活检在临床上得到推广，其具有非侵入式、易重复取样以及无肿瘤异质性等优点[7]。尤其是循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）,它与肿瘤的发生、发展密切相关[8]。既往文献报道，Septin9 基因甲基化与结直肠癌变过程密切相关[5]。本次研究拟通过荧光定量PCR 方法检测血浆中mSEPT9 水平，探讨mSEPT9对结直肠癌的诊断意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2019年6～11月在重庆医科大学附属第二医院接受肠镜检查的患者共100 例。将45 例经肠镜和病理检测确诊为结直肠癌的患者作为结直肠癌组，纳入标准：参照《中国临床肿瘤学会（ESCO）结直肠癌诊疗指南(2019 版)》综合诊断为结直肠癌的患者。排除标准：既往其他肿瘤病史，已接受放化疗、手术治疗或全身治疗，妊娠期、哺乳期妇女。将55 例经肠镜和病理检测未诊断为结直肠癌的患者作为非结直肠癌对照组，包括结直肠腺瘤患者18 例，结直肠息肉患者27 例，结直肠无异常发现患者10 例。本次研究入选患者100例，男性45 例，女性55 例，年龄37 ～85 岁，平均年龄62.33±11.37 岁。45 例结肠癌患者均接受了mSEPT9 和CEA 检测，其中31 例接受了FOBT 检查。55 例非结直肠癌患者均接受了mSEPT9 检测，其中39 例患者接受了FOBT 检查，43 例患者进行了CEA 检测。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂：Septin9 甲基化检测试剂盒（北京博尔诚），大便隐血（FOBT）检测试剂盒（四川沃文特），癌胚蛋白检测试剂盒（上海罗氏）。

1.2.2 仪器：SLAN-96S 荧光定量PCR 仪（上海宏石），沃文特全自动分析仪FA160（四川沃文特），Cobas 6000 型化学发光分析仪（上海罗氏）。

1.3 方法

1.3.1 Septin9 甲基化检测：检测流程按照试剂说明书进行，具体步骤如下：（1）提取血浆DNA；（2）亚硫酸盐转化；（3）SLAN-96S PCR 仪上机；（4）按照试剂盒说明书对结果进行判读。

1.3.2 大便隐血试验：使用沃文特公司生产的自动化粪便分析仪上机检测。

1.3.3 癌胚蛋白检测：CEA 采用化学发光法检测，结果由本院核医学科提供。

1.4 统计学分析 采用SPSS Statistics 20.0 软件进行统计分析，组间数据比较采用t 检验，组间率的比较采用χ²检验，不同诊断方法符合率的比较采用ROC 曲线。P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者年龄和性别分布情况 在100 例接受肠镜检查的患者中，结直肠癌组45 例，其中男性22 例，女性23 例，年龄35～82 岁，平均年龄61.89±12.50 岁；非结直肠癌组55 例，其中男性23 例，女性32 例，年龄43～85 岁，平均年龄62.69±10.48 岁。两组间患者年龄差异无统计学意义（t=0.349, P=0.728），两组间患者性别差异无统计学意义（χ²=0.500，P=0.480）。

2.2 结直肠癌组和非结直肠癌组中mSEPT9 检测结果 见表1。结直肠癌组患者mSEPT9 阳性率为82.22%（37/45）。非结直肠癌组患者mSEPT9 阳性率为10.91%(6/55)，结直肠癌患者和非结直肠癌患者之间mSEPT9 检测结果比较，差异有统计学意义（χ²=4.917, P ＜0.05）。将mSEPT9 检测结果与临床数据进行相关性分析显示，mSEPT9 检测结果与患者性别、年龄以及肿瘤部位无相关性(均P＞0.05)。

表1 mSEPT9 检测结果与临床特征关系[n=100，n（%）]

2.3 mSEPT9，FOBT 和CEA 在结直肠癌筛查中应用价值的比较 见表2。mSEPT9 在结直肠癌中筛查中的特异度(89.09%)和阳性预测值(86.04%)高于FOBT(75.00%, 75.61%)，其敏感度(82.22%)和阴性预测值(85.96%)高于CEA(42.22%, 60.61%)。

表2 三种检测方法在结直肠癌筛查中的应用价值[%(95%CI)]

2.4 mSEPT 检测结果与临床病理分化程度关系 在低分化结直肠癌、中分化结直肠癌和高分化结直肠癌患者中，mSEPT9 的阳性率分别为80%（4/5），82.76%（24/29）和100%（2/2），另外，有9 例分化程度不明的结直肠癌患者，其mSEPT9 阳性率为78.78%（7/9）。统计学分析显示，mSEPT9 检测结果与临床病理分化程度无相关性(χ²=0.447，P=0.800)。

3 讨论

结直肠癌的发病率和死亡率在我国恶性肿瘤中分别位列第二和第五，大多数结直肠癌发现时已进入晚期，错过了最佳治疗时机。如果定期对居民筛查，可以显著降低结直肠癌患者死亡率。液体活检作为一种新兴的检测技术，在肿瘤的精准诊断和疗效检测中具有广阔的前景，与传统的穿刺活检相比，其具有无创、低风险、低成本和高频率检测疾病进展等优势[7]。目前已发现DNA 甲基化在基因表达及细胞增殖等过程中起重要作用，为肿瘤的无创诊断和疗效监测提供了新的手段[8]。

Septin9 基因位于人类染色体17q25.3，Septin9蛋白能够调节细胞成长，防止细胞分裂过快或以不受控制的方式进行分裂增殖，具有相应的抑癌作用[9]。在结直肠癌变过程中，Septin9-v2 启动子区的CpG 岛发生高度甲基化，并且基因DNA 从凋亡坏死的癌细胞释放入外周血。因此，通过检测外周血中Septin9 特殊启动子区域的甲基化水平可 以 推测患结直肠癌的风险[3,5,9]。既往研究发现mSEPT9 检测结直肠癌的敏感度为36.6%～95.6%,特异度为77%～98.9%，其中在我国结直肠癌患者中，mSEPT9 的敏感度为69%～88%, 特异度为87%～98%[3]。本次研究结果显示，mSEPT9 检测结直肠癌的敏感度为82.22%，特异度为89.09%，与上述文献报道结果一致。mSEPT9 检测诊断结直肠癌的敏感度明显高于CEA(42.22%), 特异度高于FOBT(75%)。但是，mSEPT9 诊断结直肠癌的敏感度低于FOBT（100%）,与YAN 等[6]分析结果相反，可能是因为未对所有患者进行FOBT 检测，以及患者采集粪便样本时依从性较差，其采集手法对结果影响较大。mSEPT9 筛查结直肠癌特异度略低于CEA（93.02%），可能是因为没有对全部患者进行CEA 检测。另外，本次研究还发现mSEPT9 检测结果与患者性别、年龄、病例分化程度等没有相关性（P＜0.05）。

本次研究存在一些不足之处，未对所有纳入病例进行FOBT 和CEA 检测，未分析mSEPT9 水平与结直肠癌临床分期的关系。另外，本次研究中在部分胃癌、肝癌、肺癌和胰腺癌患者中发现mSEPT9 检测结果为阳性，但由于样本量不足，未做详细分析。

综上所述，mSEPT9 作为一个新的结直肠癌标志物，具有较高的灵敏度和特异度，并且具有无创、采样方便、方法稳定等优势，可以作为临床诊断结直肠癌的辅助手段。