沉默FGF4基因表达对肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

孙凡童 李莹 朱秋明

哈尔滨医科大学附属第一医院肿瘤一科150001

肺癌是对人类健康威胁最大的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率增长极快[1]。长期大量吸烟与肺癌的发生关系密切。此外,接触环境致癌物、电离辐射、既往肺部慢性感染及大气污染等也与肺癌发生有关[2]。伴随基因组学及现代生物技术的发展,基因治疗已成为替代化学治疗的一大热点和趋势。成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor,FGF)可直接促进肿瘤细胞增殖,参与各种内分泌信号转导、细胞增殖、胚胎发育、分化的调控及血管生成,在大多数恶性肿瘤中存在异常表达[3-4]。本研究通过RNA 干扰技术抑制人肺癌A549细胞中FGF4的表达,观察其对人肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌A549细胞株 (中国科学院上海生命科学研究院细胞库),针对FGF4 siRNA 及阴性对照siRNA (苏州吉玛基因股份有限公司),DMSO (北京索莱宝生物公司),胎牛血清、DMEM 培养基 (江苏凯基生物技术股份有限公司),Annexin-V/PI试剂盒 (北京索莱宝生物公司),Bcl-2及Bax抗体(北京中杉金桥公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将A549细胞培养于含10%胎牛血清和青霉素100 U/ml、链霉素100 ng/L 的DMEM 培养基中,培养箱内温度为37 ℃,CO2体积分数为5%,每3 d传代1次,更换新鲜培养液,取对数期生长的细胞进行实验,细胞密度达到80%左右,用胰酶消化进行实验。

1.2.2 免疫荧光法检测A549细胞中FGF4表达 细胞消化后接种于六孔板中,移液管吸除培养液后PBS 洗3 遍,4%多聚甲醛溶液固定15 min,0.1% Triton X-100作用20 min后用含10%血清的封闭液封闭25 min,加FGF4抗体,24 h后加入带红色荧光的二抗,室温下避光孵育1 h,甘油封片后荧光显微镜下观察FGF4表达。

1.2.3 siRNA 转染及细胞分组 按照LipofectamineTM2000试剂转染,PCR 方法检测转染效率。细胞分3组：空白对照组(无特殊处理)、siNC组(转染空白质粒)和siFGF4组(稳定转染干扰FGF4表达的siRNA),细胞转染48 h后,进行后续实验。

1.2.4 CCK-8检测细胞增殖能力 细胞接种于96孔板中,细胞密度调整为5×104个/L,每组设5个复孔,同时设置空白孔 (有培养基,无细胞),按照上述分组方法孵育24 h 后将培养液吸出,PBS轻轻冲洗3次,每孔分别加入20μl已配置含的10%CCK-8溶液,培养1 h后测定450 nm 各孔的吸光值。

1.2.5 Annexin V/PI检测凋亡 用不含EDTA的胰酶消化A549细胞后制备细胞悬液,离心半径为10 cm,1 000 r/min离心5 min并收集细胞,预冷的PBS洗涤细胞3次,收集细胞并用100μl缓冲液重悬细胞,加入5μl Annexin-V 和10μl PI,轻轻混匀,避光反应10 min后再次加入100μl缓冲液,1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 Hoechst 33258染色法检测凋亡 A549细胞接种于12孔板中,调整细胞密度至5×104/ml,4%多聚甲醛固定细胞10 min,去固定液并用PBS冲洗2 次,PBS 洗涤时手动晃动数次。加入Hoechst染色液后室温避光反应10 min,PBS洗涤2次后再超净台中避光风干,倒置荧光显微镜下观查并拍照。Hoechst 33258染色剂能穿过细胞膜嵌入细胞核DNA,使之发出明亮的蓝色荧光。非凋亡细胞呈现荧光深浅不一的结构样特征。凋亡的细胞核染色增强,染色质浓缩、边集,呈团块状,可见核碎片。

1.2.7 蛋白质印迹法 (Western blot)检测细胞内Bcl-2 和Bax 的蛋白表达 提取蛋白质后以Brandford法测定每个蛋白样品的蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳,设置一抗稀释浓度为1∶1 000,二抗稀释浓度为1∶2 000,ECL化学发光法显影,统计学分析结果以样本目的蛋白的光密度比内参条带的光密度计算相对表达率。

1.3 统计学分析 SPSS 19.0统计学软件分析数据,所有数据以x-±s表示,两组数据比较采用t检验,多组数据比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫荧光检测A549细胞中FGF4的表达

FGF4蛋白在细胞核及细胞浆中均有表达,如图1所示 (红色荧光标记)；蓝色荧光标记的代表DAPI染色的细胞核。

2.2 FGF4下调抑制A549细胞增殖能力 CCK-8结果显示,siFGF4组细胞增殖能力明显受到抑制(51.10%±3.51%),与空白对照组 (99.05%±3.11%)和siNC 组 (99.00%±3.59%)比较差异均有统计学意义(F=46.73,P＜0.01),空白对照组与siNC 组比较差异无统计学意义 (t=0.01,P＞0.05),见图2。

图2 转染siFGF4后的A549细胞增殖率

2.3 Western blot法检测A549细胞中FGF4蛋白表达 与空白对照组 (101.35% ±3.41%)及siNC组 (99.80%±2.41%)比较,siFGF4 组的蛋白表达 (40.36%±5.37%)明显降低 (F=78.37,P＜0.01),见图3。

2.4 下调FGF4表达促进A549细胞凋亡 流式细胞仪的检测结果显示,siFGF4组细胞凋亡率为(59.99%±5.52%),高于空白对照组 (2.98%±2.24%)及siNC 组 (4.76%±2.05%),差异有统计学意义(F=67.54,P＜0.01),空白对照组与siNC组比较差异无统计学意义(t=0.43,P＞0.05),见图4。

图3 siRNA 转染后FGF4表达水平变化

2.5 下调FGF4表达对A549细胞凋亡的影响

空白对照组及siNC 组未见亮蓝色凋亡细胞,siFGF4组有散在亮蓝色凋亡细胞(图5)。

2.6 FGF4 表达下调影响凋亡相关蛋白Bcl-2 和Bax的表达 Western blot结果显示,与空白对照组及siNC组相比,siFGF4组Bcl-2的蛋白表达水平明显降低(F=51.53,P＜0.01),Bax的蛋白表达水平明显升高 (F=41.33,P＜0.05,图6)。

3 讨论

图1 免疫荧光检测A549细胞中成纤维细胞生长因子4的表达 A：成纤维细胞生长因子4的表达；B：DAPI染色的细胞核；C：A与B合并

图4 流式细胞技术检测siFGF4对A549细胞凋亡率的影响 A：空白对照组；B：siNC组；C：siFGF4组

图5 下调成纤维细胞生长因子4表达促进A549细胞凋亡 A：空白对照组；B：siNC组；C：siFGF4组

手术治疗是肺癌首选治疗方法,通过手术可以完全切除肺癌原发病灶及有可能转移的淋巴结,达到临床早期诊断与治疗[5]。但是对于侵袭性纵隔淋巴结转移者及已有广泛转移的晚期肺癌者来说,手术很难完全清除病灶。90%以上的肺癌需要化学治疗,化疗药物通过作用于肿瘤细胞生长和繁殖的不同阶段来抑制或杀死肿瘤细胞,但常伴有不同程度的不良反应[6]。它们在杀伤肿瘤细胞的同时,对人体正常的免疫防御系统中的细胞及组织也有杀伤作用,这些健康屏障破坏后,癌细胞会进一步扩散,造成严重后果[7]。因此,除早期手术切除以外,探求新的治疗策略及多途径治疗机制的药物日益受到广大学者的关注。

基因靶向治疗已经成为肺癌治疗中的一大热点,继续积极寻找新的靶向基因对明确肺癌发生发展机制及治疗肺癌有重要意义。FGF4主要表达在肿瘤细胞上,已经被证明是癌基因,参与细胞衰老调控、与肿瘤的发生、发展有关[8-9]。研究显示,FGF4在肺癌中呈高表达。李江超等[10]通过免疫组织化学技术对1例肺癌患者癌组织及癌旁组织进行FGF4抗体检测,发现癌组织中的FGF4表达量较癌旁组织高。

本研究选用A549 细胞中FGF4 表达较高细胞,采用siRNA 转染技术沉默FGF4的表达水平,进一步观察FGF4基因对肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响。研究结果显示,沉默FGF4 表达后,A549细胞增殖率显著降低,凋亡率显著增加。此外,本实验进一步对沉默FGF4的表达抑制人肺癌A549细胞增殖活性的机制进行初步探讨。

图6 下调FGF4表达对A549细胞内Bcl-2和Bax表达的影响

细胞凋亡具有复杂的分子生物学特征,涉及一系列基因的表达、调控及激活。细胞凋亡过程中清除了异常细胞,保证了生物体内环境的稳定,为促进系统发育发挥作用。多种因素如衰老、药物、氧化损伤、射线等,能够诱发凋亡反应,当机体正常的凋亡过程受到破坏或凋亡过程紊乱时,引发多种疾病,例如自身免疫性疾病及肿瘤。Bcl-2家族是线粒体凋亡途径中的重要调节因素,其中,Bcl-2属于抗凋亡基因,Bax属于促凋亡基因,通过调节线粒体膜的通透性诱导细胞凋亡。本研究中,Western blot结果显示,FGF4 的表达受抑制后,Bcl-2表达下调,Bax的表达上调。

上述结果表明,沉默FGF4 表达可抑制肺癌A549细胞增殖、诱导A549细胞凋亡,其机制与改变凋亡相关因子表达有关。本研究为肺癌基因靶向治疗及机制研究提供新的方法,对改善肺癌预后具有潜在价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突