AIB1影响卵巢癌预后及增强卵巢癌对顺铂抵抗的研究

李传棠，吴嘉俊，邹争志

（1.广州市增城区人民医院妇产科，广州511300；2.华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学教育部重点实验室，广州510631；3.华南师范大学生物光子学研究院，广东省激光生命科学重点实验室，广州510631）

乳腺癌扩增因子（amplified in breast cancer 1，AIB1）又称 NCOA3、SRC3、p/CIP、RAC3、ACTR、TRAM-1，属于核受体共激活因子（nuclear receptor coactivator，NCOA）家族，是一类相对分子质量约为160的辅激活因子，主要功能为与核受体结合并调节基因的转录[1]。该家族主要包括3个成员，分别是NCOAl、NCOA2、NCOA3。研究表明，NCOA家族与一些疾病的形成和发展有重要的关系，目前该家族蛋白作为疾病治疗的靶点越来越受到重视，且开发出来的相应的靶向药物已开展临床试验。aib1是一个重要的癌基因，关于其在肿瘤发生发展中的功能报导较多。现已发现aib1基因在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌以及前列腺癌等多个激素相关的肿瘤中高度扩增，其蛋白表达也显著升高[2-4]。在非激素相关肿瘤（如食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、泌尿道肿瘤、肝细胞癌及白血病）中均发现AIB1的高表达和扩增[5-6]。

Li等[4]研究表明，AIB1能与一些转录因子相互作用，通过激活或抑制下游基因的转录调控肿瘤的发生和发展。如其与E2F转录因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）、激活蛋白 1（activated protein-1，AP-1）、核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、信号传导及转录激活剂6（signal transducers and activators of transcription 6，STAT6）等转录因子相互作用，可调控丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，P13K/AKT）、胰岛素样生长因子 -1（insulin-like growth factor 1，IGF-l）等信号通路来控制肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡。Song等[6]研究发现，AIB1通过与星形胶质细胞磷酸化蛋白 3（phosphoprotein enriched in astrocytes，PEA-3）和AP-1等相互作用，促进了基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）家族蛋白的表达，从而促进了肿瘤细胞的转移。在乳腺癌和肺癌中靶向抑制AIB1能够明显抑制肿瘤细胞的活力，诱导肿瘤细胞凋亡，且与组蛋白去乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂联合使用具有协同抗肿瘤作用。另外，Wang等[7]发现，AIB1促进了乳腺癌对化疗药紫杉醇产生耐药，且在耐药的乳腺癌细胞中高表达。其机制在于，AIB1作为核受体亚家族5，A组，成员2（nuclear receptor subfamily 5 group A member 2，NR5A2）的激活子协同诱导乳腺癌细胞mdc1基因的转录，从而促进修复化疗诱导的DNA损伤，导致乳腺癌化疗耐药。

在本研究中，我们首次发现AIB1与卵巢癌患者的预后相关。通过分析TCGA数据库可知，aib1基因表达高的卵巢癌患者和顺铂治疗后的卵巢癌患者的总生存期（overall survival，OS）、进展后生存期（post progression survival，PPS）以及无进展生存期（progression-free survival，PFS）均显著降低。在卵巢癌细胞中的试验结果也表明，AIB1促进细胞对顺铂的抵抗。总之，AIB1能影响卵巢癌的预后且增强卵巢癌对顺铂抵抗。

1 材料与方法

1.1 材料

顺铂（cisplatin or cis-dichlorodiammine platinum，DDP）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购买于 Sigma 公司；BCL2、BCL2L1、AIB1 和甘油醛 -3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购买于Cell Signalling Technology公司；siRNA合成于上海吉玛公司；LipofectamineTM3000、细胞增殖试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）检测试剂盒、胰蛋白酶消化液购买于Thermo Scientific公司。AIB1过表达质粒由本课题组构建。

1.2 细胞培养

人卵巢癌细胞系（SKVO3）购于中科院上海细胞库，本试验采用含10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培养基（dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）培养基，将其置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中进行常规培养。

1.3 细胞增殖检测

取对数生长期细胞，用胰酶消化后稀释成每毫升5×104个细胞的悬液，接种于96孔板中，每孔200 μL（即 10 000个细胞），将其放置于 37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养。细胞贴壁后（至少8 h），试验组中加入不同浓度的DDP，对照组中加入与DDP最大量等体积的DMSO，每组设8个平行孔，继续培养24 h或48 h。然后按照CCK-8检测试剂盒说明书的流程完成细胞增殖检测。流程如下：试验中止前4 h，加入 CCK-8 液 20 μL，再培养 4 h，在酶联检测仪上检测450 nm波长下每孔的吸光度（optical density，OD）值，按下列公式求出细胞活力。细胞活力=（用药组平均OD值/对照组平均OD值）×100%[6]。

1.4 GEPIA分析基因表达相关性

通过在线软件 GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）[8]分析aib1和bcl2、bcl2l1在卵巢癌组织中的相关性。软件中Cut-off值选择50%，分析方法采取Pearson相关性统计分析。

1.5 Kaplan-Meier plotter分析基因生存率

通过在线软件 Kaplan-Meier plotter（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=contact）[9]分 别 分 析aib1基因与卵巢癌患者和顺铂治疗后的卵巢癌患者的OS、PPS以及PFS。软件中Follow up threshold参数选择“All”，Restrict analysis to subtypes参数选择“All”。

1.6 细胞转染

AIB1的siRNA干扰片段序列中，siRNA-sense（有义链）为：5′-GGTCCTAAGGAGTCTCCTGTCTC-3′；anti-sense（无义链）为：5′-AAAGACTCCTTAGGACCGTTC-3′。阴性对照（negative control，NC）si-RNA中，siRNA-sense 为：5′-UCCGUUUCGGUCCACAUUC-3′；anti-sense 为：5′-GAAUGUGGACCGAAACGGA-3′。根据 LipofectamineTM3 000 说明书，转染时用适量无血清培养液将siRNA（终浓度为100 nmol/L）或AIB1过表达质粒（6孔板中每孔2 μg）与 LipofectamineTM3000混匀，然后加入到细胞中，8 h后换为含10%胎牛血清培养液继续培养，并在转染后48 h内完成细胞试验[10]。

1.7 免疫印迹

收集处理过的细胞，用预冷的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗 3遍，加入适量的裂解液[50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol/L Na-Cl、1%Triton X-100、1 mmol/L Na3VO4、100 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）]，在冰上裂解 30 min，12 000 r/min 离心 15 min，收集上清蛋白液。采用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，转膜完成后，用5%奶粉液封闭，之后分别孵育一抗和二抗。A（H2O2）、B（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）液以1∶1的体积比例混合，用滤纸将膜表面液体吸干，然后加ECL（electrochemiluminescence）底物显色液（即A、B混合液），放入暗盒中并压片，5 s～5 min 后显影、定影[9]。

1.8 统计学分析

统计学方法数据均采用SPSS16.0软件进行统计学分析，所有试验重复3次，均为独立试验。计量资料采用均数±标准差表示。数据的比较分析采取t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 卵巢癌中高aib1基因表达与患者预后相关

为了评估aib1基因的表达与卵巢癌患者预后的关系，本研究通过Kaplan Meier plotter在线软件，提取了TCGA数据库中卵巢癌患者的aib1基因mRNA表达数据和预后数据，进一步进行了OS、PFS、PPS分析。OS数据完整的患者样品共1 656例，其中aib1基因高表达1 104例，低表达552例。如图1a所示，aib1基因高表达组的总生存率显著低于低表达组（P=0.000 13）。PFS数据完整的患者样品共1 435例，其中aib1基因高表达920例，低表达515例。如图1b所示，aib1基因高表达组的无疾病进展生存率显著低于低表达组（P=5.3×10-5）。PPS数据完整的患者样品数目最少，共782例，其中aib1基因高表达202例，低表达580例。如图1c所示，aib1基因高表达组的疾病进展后生存率显著低于低表达组（P=0.039 00）。

2.2 卵巢癌中高aib1表达与经过顺铂治疗的患者预后相关

化疗药DDP是临床一线用于卵巢癌治疗最常见的药。为了评估aib1基因的表达是否与顺铂治疗卵巢癌患者的疗效有关，本研究通过Kaplan Meier plotter在线软件提取了TCGA数据库中经顺铂治疗后的卵巢癌患者的数据，分析了其组织中aib1基因mRNA表达数据和预后数据，然后进行了OS、PFS、PPS分析。OS数据完整的患者样品共1 409例，其中aib1基因高表达943例，低表达466例。如图2a所示，aib1基因高表达组的总生存率显著低于低表达组（P=0.006 10）。PFS数据完整的患者样品共1 259例，其中aib1基因高表达795例，低表达464例。如图2b所示，aib1基因高表达组的无疾病进展生存率显著低于低表达组（P=4.7×10-6）。最后分析了PPS数据完整的患者，共746例，其中aib1基因高表达195例，低表达551例。如图2c所示，aib1基因高表达组的疾病进展后生存率显著低于低表达组（P=0.037 00）。

2.3 AIB1促进卵巢癌细胞对顺铂抵抗

以上试验研究结果指出，在经过化疗药DDP治疗的卵巢癌患者中，高表达aib1的基因患者OS、PPS、PFS都显著降低，这表明aib1基因可能增强了卵巢癌对DDP的抵抗。为了直接验证AIB1与卵巢癌细胞对DDP的敏感性有关，本研究选择了SKVO3作为细胞模型，通过CCK-8试验进行顺铂敏感性试验来探讨在SKVO3细胞中上调或下调AIB1表达后DDP对卵巢癌细胞活力的影响。如图3所示，使用浓度为 0、10、20、40、80 μmol/L 的 DDP 处理细胞24 h和48 h后，完成了CCK-8试验检测的细胞活力。在DDP浓度为0 μmol/L时，即不存在药物的情况下，干扰了AIB1表达后，细胞活力在24 h后减少了5.6%，在48 h后减少了10.1%，表明干扰AIB1表达能减慢细胞的增殖。在加了DDP后，随着DDP浓度的增加，细胞的活力显著降低。在加入40 μmol/L的DDP 24 h后，细胞活力从70%降到了45%，相对细胞活力减少了近40%（图3a、3b），表明干扰AIB1能够显著增强DDP对卵巢癌细胞活力的抑制。同样，未经过DDP处理的细胞，即DDP为0 μmol/L时，过表达AIB1的SKVO3细胞在24 h和48 h后细胞活力均有所增加，但在24h没有显著差异（P>0.05），而在48 h后增加了11.6%，表明过表达AIB1能适当促进卵巢癌细胞的增殖。在加入DDP后，过表达AIB1能够显著抑制DDP对细胞活力的抑制。如在加入浓度为80 μmol/L的DDP处理24 h后，细胞的活力从34%增加到了64%，相对细胞活力增加了近1倍。在加入不同浓度的DDP 48 h后，过表达AIB1的SKVO3细胞相对活力同样显著增加（图3c、3d）。上述结果表明，AIB1增强了卵巢癌细胞对DDP的抵抗。

图1 卵巢癌中高aib1表达与患者预后相关Fig.1 High aib1 expression is associated with poor prognosis in ovarian cancer

图2 卵巢癌中高aib1表达与经过顺铂治疗的患者预后相关Fig.2 High aib1 expression is associated with poor prognosis in ovarian cancer with cisplatin treatment

图3 AIB1促进卵巢癌细胞对顺铂抵抗Fig.3 AIB1 enhances ovarian cells resistant to cisplatin

2.4 AIB1调节卵巢癌细胞中BCL2、BCL2XL的表达

上述结果表明，AIB1显著增强了卵巢癌细胞对DDP的抵抗。BCL2和BCL2L1是两个重要的调节细胞凋亡的蛋白。已有报道表明，BCL2和BCL2L1能促进癌细胞对DDP的抵抗[11]。为了解AIB1是否调节了BCL2和BCL2L1的表达，本研究在卵巢癌细胞SKVO3中，通过干扰AIB1的表达，采用Western blot方法进一步检测了BCL2和BCL2L1的表达。结果如图4所示，转染AIB1干扰RNA后AIB1的表达明显下降，同时BCL2和BCL2L1的表达也显著下降。在SKVO3细胞中转染了AIB1过表达质粒48 h后，AIB1的表达明显上升，同时BCL2和BCL2L1的表达也显著上升。这些结果表明，AIB1增强卵巢癌细胞对DDP的抵抗与BCL2和BCL2L1有关。

2.5 卵巢癌组织中bcl2、bcl2l1和 aib1基因表达显著相关

为了继续在卵巢癌组织中验证aib1基因与bcl2、bcl2l1基因的表达相关。本文通过在线软件GEPIA分析了TCGA数据库中的卵巢癌数据，通过Pearson相关分析分析了bcl2、bcl2l1基因和aib1基因mRNA表达的相关性。如图5a所示，bcl2和aib1表达呈正相关（r=0.22，P=2.8×10-6），而由图 5b 可知，bcl2l1和aib1表达同样也具有正相关性（r=0.38，P=2.8×10-16），具有统计学显著意义。这些结果表明AIB1在卵巢癌细胞可能正向调控BCL2和BCL2L1的表达。

图4 AIB1调节卵巢癌细胞中BCL2、BCL2L1的表达Fig.4 Both BCL2 and BCL2L1 are positively correlated with AIB1 in ovarian cancer

图5 卵巢癌组织中bcl2、bcl2l1和aib1表达显著相关Fig.5 Both bcl2 and bcl2l1 are positively correlated with aib1 in ovarian cancer

3 讨论

近年来，卵巢癌在我国已成为女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，特别是在城市女性人群中发病率仍不断上升，总体表现为发病年龄趋向于年轻化。化疗是卵巢癌的主要治疗手段之一[12]，其中DDP是临床上用于卵巢癌治疗最常用的化疗药。然而卵巢癌化疗疗效尚不令人满意，原因主要为癌细胞对化疗药物的敏感性差。顺铂治疗中也常发现患者对DDP的敏感性较差，并且即使是刚开始对DDP敏感的患者，在使用一段时间后便开始产生耐药[13-14]。目前认为，癌细胞对传统化疗药不敏感的根本原因在于细胞促凋亡蛋白的低表达和抑制凋亡蛋白的高表达[1]。AIB1和很多肿瘤的发生发展关系密切。Wang等[7]的研究表明，AIB1能够协助肝受体同源物 1（liver receptor homolog 1，LRH1）转录激活DNA损伤关卡蛋白1（mediator of DNA damage checkpoint 1，MDC1）的表达并增强DNA的损伤修复能力，从而促进乳腺癌细胞对顺铂和阿霉素的耐药。本研究发现，AIB1能促进卵巢癌细胞对顺铂抵抗，且AIB1上调了BCL2和BCL2L1的蛋白表达。BCL2和BCL2L1是控制线粒体凋亡途径的关键蛋白，这两个蛋白的高表达能够抑制线粒体途径的细胞凋亡。多数化疗药的抗癌活性都是通过下调BCL2和BCL2L1的表达，从而激活线粒体途径诱导细胞的凋亡[15-16]。比如Zou等[17]的研究发现，Aurora-A抑制剂下调了BCL2的表达，从而诱导癌细胞凋亡。在非小细胞肺癌中发现硫链丝菌素诱导的细胞死亡也与BCL家族蛋白有关[18]。此外，DDP诱导癌细胞的凋亡也需经过线粒体途径，并且BCL2和BCL2L1的高表达能够抑制顺铂诱导的癌细胞凋亡[19]。因此可推断，本研究中AIB1促进卵巢癌细胞对DDP的抵抗是通过上调BCL2和BCL2L1表达实现的。另外本研究中所用到的是TCGA数据库中的数据，该数据库中的基因表达数据是基因mRNA的表达量。aib1基因和bcl2、bcl2l1基因mRNA水平表达的相关性表明，AIB1可能是通过转录上调了BCL2、BCL2L1的水平促进了癌细胞对DPP抵抗。这需要进一步分析AIB1是否对BCL2、BCL2L1的启动子区活性有调节，以及是否直接结合在了这两个基因的启动子区上。总之，aib1的表达高低能够分别反映卵巢癌患者和顺铂治疗后的卵巢癌患者的OS，PPS和PFS。这些结果说明，AIB1可以作为卵巢癌预后的指标以及一个治疗的重要潜在靶点。