川北地区核桃介壳虫的鉴定及最适防治时期研究

曾全, 陈志宏, 王戌勃, 肖银波, 杨远亮

1. 四川省林业科学研究院，四川 成都 610081；

2. 四川雪宝顶国家级自然保护区管理局，四川 绵阳 622550；

3. 西南林业大学云南生物多样性研究院，云南 昆明 650224

介壳虫是一类重要的农林业经济害虫，具有虫体小、鉴定和防治难度大等特点。该类群包含多个科属的种类，仅《中国动物志》第二十二卷蚧总科记录，在我国分布的种类就达7科330余种[1]。介壳虫主要吸食植物汁液，造成受害植物长势衰弱，使得生长缓慢或停止，严重时可造成植株成片死亡。川北是指以。川北地区核桃种植面积广，其中仅广元市核桃基地面积就已超过13万hm2，核桃介壳虫在川北地区存在一定的扩散风险。调查发现，该虫在广元、巴中、南充为中心的四川北部地区为害较为严重省内未见相关核桃介壳虫危害的研究，为指导林间科学防治，有必要开展该地区核桃介壳虫相关生物学特性研究。

1 研究区概况

研究区位于四川省广元市朝天区中东部中子镇和曾家镇，E：105°58′53″～106°10′27″，N：32°32′60″～32°44′55″，海拔范围 643 m～1 493 m，中子核桃品种园平均海拔790 m，曾家镇中柏村平均海拔1 255 m。朝天区年均气温15.0 ℃左右，一月均温4.7 ℃，七月均温25.9 ℃；曾家片区中山岩溶台地年均气温12.0 ℃，一月均温1.6 ℃，七月均温19.9 ℃。海拔900 m以下的河谷阶地多为新积土；海拔900～1 500 m之间为黄壤土类；海拔1 500 m以上为黄棕壤土类。中子核桃品种园有川早、南福1号、冕漾、巴山乌米仔和白龙1号等20多个品种，树龄10～30年，树高2～7 m，生长发育良好。曾家镇中柏村主要种植品种为川早、乌米仔，品种相对单一，树龄15～30年，树高5～7 m，部分树势受到介壳虫影响严重。

2 研究方法

2.1 主要材料

从中子核桃品种园、曾家镇中柏村核桃树枝干上采集介壳虫，样品采集时分别用75%乙醇和无水乙醇（分析纯）保存。75%乙醇保存的样品用于玻片标本制作，以便进行形态学鉴定；无水乙醇保存的样品用于DNA提取、扩增和测序。

形态学鉴定试剂：解剖针、凹面皿、解剖镜、梯度酒精、10%NaOH、品红、苯酚、二甲苯、树脂、光学显微镜（尼康N100）。

分子生物学鉴定试剂：PCR管、离心管（1.5 mL）、枪头、移液枪（Eppendorf）、低温高速离心机（MR22）、分析天平（BSA124S）、微波炉（Galanz）、电泳仪（DYY-6D型）、PCR仪（BIO-RADS1000）、凝胶成像系统（GeIDoc-It2Imager）、DNA提取试剂盒（DNeasy Blood & Tissue Kit）。

2.2 研究方法

选取介壳虫成虫，去除乙醇和杂质。用昆虫针刺破表皮，取其体液做分子鉴定，表皮留作形态学鉴定。

2.2.1 介壳虫形态鉴定

采用上海昆虫博物馆的玻片制作程序[2]，使用中国盾蚧志[3-5]分类检索表在复式光学显微镜下检视凭证标本。通过制作玻片标本，使用光学显微镜对触角、背腺管、前气门、臀板和臀叶等部位的形态特征进行观察。

2.2.2 DNA 提取，PCR 扩增和测序

采用试剂盒的方法提取DNA。选用Qiagen公司的DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒，按照使用手册的步骤提取盾蚧的总基因组DNA。获取的DNA模板置于-20 ℃保存。COⅠ的PCR扩增选用30 μL体系：3 μL DNA 模板，上下游引物各 10 pmol，10 μL ddH2O 和 15 μL Premix Taq (LA Taq Version 2.0 plus dye)。扩增 COⅠ片段的引物为： PcoF1 5’-CCTTCAA CTAATAAAAATATYAG-3’； LepR1 5’-TAAACTT CTGGATGTCCAAAAAATCA-3’[6]。COⅠ的 PCR 反应程序参考[7]。使用1%的琼脂糖胶对PCR产物进行电泳检验。最亮条带的产物在ABI3730xlDNA分析仪（Applied Biosystems）中进行双向测序。测序工作由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司完成。

2.2.3 序列分析

使用Bioedit软件[8]比对序列。在MEGA6[9]中翻译成蛋白质，以检验是否有假基因的存在。BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）是一个基于序列局部相似性的比对工具。该算法的基本思路是首先找出检测序列和目标序列之间相似性程度最高的片段，并作为内核向两端延伸，以便找出尽可能长得相似序列片段。川北采集到的盾蚧序列提交到NCBI数据库中进行BLAST比对。覆盖90%区域相似度达到98%以上COⅠ序列被认定为该种（见表1）。

2.2.4 介壳虫生活史研究

选择介壳虫危害较重的曾家镇中柏村进行生活史研究。从样株的东、南、西、北4个方向分别选择1～2个1年生枝条，选取一段长20 cm的健康和受害并存枝条。其中，健康部位留取15 cm，受害部位内留5～7个雌成虫，各虫之间保持一定距离，再于两端涂凡士林阻止其他昆虫爬入影响实验结果[10]。开始每隔1 d观察1次，并记各虫态发育进程，待若虫固定后，每周观察2次，记录其生活史发育进程。野外观察期为3月下旬至10月中旬。每次在相邻受害植株取各方位的一段带虫枝叶，带回室内在解剖镜下详细观察同样的内容，作为固定观察的补充。

3 结果与分析

3.1 形态学鉴定

对制作的12分玻片标本进行了形态学鉴定，结果表明危害核桃的介壳虫为桑白盾蚧Pseudaulacaspis pentagona（Targioni-Tozzetti）。桑白盾蚧属于盾蚧科（Diaspididae）白盾蚧属（PseudaulacaspisMac Gillivray）。

形态鉴定特征如下：触角呈小突起，上有刚毛1根，着生在口器的前方，互相接近。前气门伴有一群盘状腺孔，约 6～17 个，后气门没有盘状腺孔。各腹节侧辦的腹面有很多腺刺，约5～10 个，后胸上有5～9 个。中胸侧辦上有腺瘤。前胸区及中胸亚缘有微小的腺管分布。肛孔靠近臀板基部。围阴腺5群。臀板背腺大小与边腺相仿，背腺的腹节排列成行，背腺管管腺端口双环。臀叶2～3对，中臀叶发达，左右两片在基部有鞍片相连；第二臀叶分为两瓣，内瓣长过于阔，外瓣很小，不明显。第三臀叶不发达，呈两齿状突出，相当于第五和第四臀叶的位置，臀板边缘也有相似的突出。第二和第三臀叶二分。背板缘鬃发达，端部刺状或分叉。在中臀叶之间有刚毛1对（见图1）。

3.2 分子鉴定

介壳虫COⅠ基因PCR扩增，利用线粒体通用引物扩增介壳虫COⅠ基因，PCR产物1%的琼脂糖凝胶电泳检测获得690 bp单一明亮条带，与预期目的基因片段大小一致（见图2）。

图1 （1.P. pentagona（Targioni-Tozzetti）（仿 Ferris 1936）2.玻片标本 3.触角 4.背腺管 5.臀板 6.前气门 7.臀叶）Fig.1 Morphological characteristics of P. pentagona

图2 COⅠ基因 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Agarose Gel Electrophoresis results of PCR amplification products of CO Ⅰ gene

去除两端不稳定的碱基，我们获得2条669 bp的COⅠ序列，通过BLAST序列比对，相似度最高的前4个结果对应的物种均为桑白盾蚧，相似度范围为95.99～99.08%（见表2）。

3.3 桑白盾蚧生活史

自2018年4月至2019年11月，完成了桑白盾蚧野外生活史观察。该虫在川北地区1年发生2代，主要危害期在5月中旬至6月上旬、9月中旬至10月中旬，以受精雌成虫在核桃枝干上越冬。3月中旬开始产卵，4月中旬为一龄若虫孵化盛期，即若虫大量涌散，寻找适宜的部位开始为害；5月上中旬开始以二龄若虫固定在新梢、1年生枝条上开始取食危害；6月上旬开始化蛹，中下旬出现雌成虫；8月下旬产下第2代卵；9月中下旬出现第2代一龄若虫，开始危害核桃枝梢、叶柄和叶片；10月上旬为二龄若虫危害盛期并出现雄蛹；10月中下旬出现雄成虫和雌成虫。

桑白盾蚧若虫期虫体尚未完全定殖，体表未分泌蜡质，施药能较好接触虫体，是防治该虫的最佳时间。因此，在4月上旬至5月中旬、9月中旬至10月中旬施用触杀性药剂可以达到较好的防治效果，为林间最适防治时间。而成虫分泌较厚的蜡质介壳，一般药剂难与虫体接触，防治效果不理想。

4 讨论

通过形态学和分子生物学鉴定，弄清了危害核桃的介壳虫为桑白盾蚧，基本掌握了该虫在川北地区的年生活史。桑白盾蚧在陇南部分乡镇造成危害，核桃园有虫株率达到85%以上，对当地核桃产业的发展构成严重威胁[11]，川北地区紧邻陇南，结合川北大面积种植核桃的现状，桑白盾蚧存在一定的扩散风险。文献资料表明，桑白盾蚧不仅危害核桃，还危害花椒、樱桃、李、杏等经济林[12]，对龙泉驿区桃树形成了严重威胁[13]，研究中还发现该虫危害猕猴桃枝条和叶片。此外，在我省林业高质量发展和建设现代林业园区的需求下，现代核桃产业建设不仅需要应对传统核桃病虫害危害，更有必要加强潜在或新发病虫害的监测和研究。王让军[11]发现在陇南地区该虫的最佳防治时间为5月中上旬和8月上旬，朝天区维度偏南，物候相对较早，而8月极端温度较高，造成第2代桑盾蚧发生相对较晚。

表1 BLAST 比对结果Tab.1 Comparison results of BLAST

表2 桑白盾蚧生活史Tab.2 Life history of P. pentogona

为有效避免核桃农药残留，结合当地核桃产业高质量发展的需求，可开展生物防治研究。刘茂祥[14]等人对桑树上的桑盾蚧天敌种类进行了研究，共发现天敌11科23种。本次研究发现野外几种桑白盾蚧天敌，分别是捕食性天敌红星盘瓢虫Phrynocaeia congener(Billberg)、二双斑唇瓢虫Chiloccrus lijugsMulsant和寄生性天敌茧蜂Phanerotomasp.，在进行必要的化学防治时应注意对天敌昆虫的保护。