基于QuEChERS液相色谱-串联质谱法测定茶叶中除虫脲残留量的不确定度评定

武 源，覃慧丽

除虫脲又名敌灭灵，是一种苯甲酰胺类杀虫剂，具有对人畜低毒、对环境无公害等特点，其已被广泛用于茶园害虫的防治[1-5]。茶叶产业关乎我国农业农村发展，茶叶质量安全影响我国茶叶对外贸易，近年来，农药残留已成为影响茶叶质量安全的重要因素之一，除虫脲及其降解产物残留问题日益突出[6-8]，严重影响到茶叶质量安全。我国国家标准GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定茶叶中除虫脲的最大残留限量为20 mg/kg，日本和欧盟等进口国家或地区均对茶叶制定了严格的农药残留限量[9-10]，日本规定除虫脲在茶叶中最大残留限量为20 mg/kg[11]。由于茶叶样品基质复杂，含有大量的生物碱、色素、咖啡因、茶多酚等干扰物质，使得农残检测难度增大。为确保分析结果的准确性，对检测结果进行不确定度评定是必要的，不确定度评定对于检测过程的质量把控具有重要意义[12]。

目前除虫脲在液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法的不确定度判定研究基本空缺。本研究依据文献[3-16]，对测定茶叶中除虫脲残留量进行了分析与评定，明确了QuEChERS液相色谱-串联质谱法测定茶叶中除虫脲残留量不确定的主要影响因素，为评价除虫脲残留量测定结果的准确性和可靠性提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

提取试剂：4 g MgSO4，1 g NaCl，0.5 g三水合二柠檬酸二钠，1 g柠檬酸钠及两颗陶瓷均质子，美国Agilent公司；净化试剂管：1 200 mg MgSO4，400 mg PSA，400 mg C18，200 mg GCB，美国Agilent公司。

除虫脲对照品（纯度99.65%），德国Dr. Ehrenstorfe公司；三苯基磷酸酯对照品（TPP，纯度99.6%），德国Dr.Ehrenstorfe公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯），德国Merck公司；甲酸、乙酸铵（均为色谱纯），德国Fluka公司。

1.2 仪器与设备

Xevo TQ-S 液 质 联 用 仪、ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱（2.1×50 mm，1.7 μm），美国WATERS公司；XP26微量电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；IKA VORTEX 4 basic涡旋振荡器，德国IKA公司；TTL-DC Ⅱ型氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；SIGMA 3-3OK离心机，德国SIGMA公司；Milli-Q超纯水设备，美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

阴性基质溶液：称取不含目标物的茶叶按前处理步骤处理即得。

除虫脲标准储备液（500 μg/mL）：精确称取5 mg除虫脲对照品于10 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻线。

TPP内标储备液（500 μg/mL）：精确称取5 mg内标物对照品TPP于10 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻线。

除虫脲标准工作液（500 ng/mL）：精确吸取0.02 mL的除虫脲标准储备液于20 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻线。

TPP内标工作液（5 μg/mL）：精确吸取0.2 mL的内标储备液于20 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻线。

基质标准工作液：用移液枪分别精确移取0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mL的除虫脲标准工作液于10 mL的氮吹管中，加入0.01 mL内标工作液，氮吹近干，准确加入1.0 mL阴性基质溶液，涡旋复溶，即得基质标准工作液。以系列标准溶液中除虫脲与内标TPP质量浓度的比值（C除虫脲/CTPP）为横坐标，以除虫脲与内标TPP定量离子峰面积的比值（A除虫脲/ATPP）为纵坐标，绘制基质标准曲线。

1.3.2 提取

茶叶粉碎后进一步充分混匀，准确称取2 g（精确至0.01 g）茶叶置于50 mL具塞离心管中，加10 mL水涡旋混匀，静置30 min。离心管中加入0.10 mL TPP内标工作液，10 mL乙腈，加盖涡旋振荡30 s后加入提取试剂，立即剧烈振荡1 min，防止结块。以转速4 000 r/min离心5 min，待净化。

1.3.3 净化

取8 mL乙腈提取液转移至15 mL净化试剂管中，盖紧离心管，充分涡旋振荡1 min，以转速4 000 r/min 离心5 min，净化液过0.22 μm滤膜后，取1 mL氮吹近干，加入1 mL水-甲醇（9∶1，V/V）涡旋混匀后上机分析。

1.3.4 LC-MS/MS条件1.

3.4.1 液相条件

1.3.4.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；多反应监测（MRM）采集模式，正离子扫描。目标物和内标的保留时间、定量离子对和定性离子对见表1。

表1 化合物保留时间及离子对

1.4 数学模型的建立

茶叶中目标物残留量X按公式（1）计算：

式中：X为茶叶中除虫脲的残留量，mg/kg；C0为从基质标准工作曲线得到的茶叶溶液中除虫脲的质量浓度，ng/mL；V为茶叶经前处理后的稀释体积，mL；m为称取茶叶质量，g。

2 结果与分析

2.1 称量标准物质及配制基质标准曲线时产生的不确定度μr（2.1）

2.1.1 除虫脲纯度产生的不确定度μr(P)

除虫脲的纯度为99.65%，查阅除虫脲对照品标准证书，其不确定度U95为0.30%，在95%置信水平下，k=2，则标准不确定度μr(P)=0.15%，相对标准不确定度μr(P)=0.001 5。

2.1.2 除虫脲称量产生的不确定度μr(M)

精密称量除虫脲对照品5.757 mg，用乙腈稀释并定容至10 mL，得到除虫脲标准储备液。微量电子分析天平校准不确定度为主要分量，根据分析天平检定证书，本试验所用天平的最大允许误差为0.005 mg，按照均匀分布计算则除虫脲标不确定度μr(M)=0.002 9 mg，相对标准不确定度μr(M)=0.000 5。

2.1.3 配制基质标准曲线时产生的不确定度μr(V)

根据JJG196—2006《常用玻璃量器》[17]检定规程的A级最大允许误差（以下玻璃量器均按A级进行评定）及广西壮族自治区计量检测研究院提供的实验室移液枪的检定证书，按照式（2）计算量器容量允差产生的相对标准不确定度μr(V校准)：

式中：a校准为玻璃器具校准引起的体积偏差；k取平均分布，即

实验室环境温度波动范围为（20±5）℃，20℃乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3℃-1，根据式（3）计算室温波动引起的相对标准不确定度μr(V温度)：

式中：a温度为实验环境温度波动带来的溶剂体积偏差；k取平均分布，即

分别移取0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mL的除虫脲标准工作液于10 mL的氮吹管中，加入0.01 mL内标工作液，氮吹近干，用移液枪准确加入1 mL阴性基质溶液，充分涡旋。实验中配制基质标准曲线时移取和定容步骤，用到不同规格的移液枪和容量瓶，均按平均分布计算各分量合成配制基质标准曲线时产生的不确定度μr(V)（表2）。

基质标准曲线稀释过程由上述19次移液，2次定容完成，配制基质标准曲线时产生的不确定度μr(V)=0.021。

表2 量器引入相对标准不确定度

由此，称量标准物质及配制基质标准曲线时产生的不确定度μr（2.1）：

2.2 标准曲线拟合过程产生的不确定度μr（2.2）

配制除虫脲6个质量浓度分别为5.734、11.47、28.67、57.34、114.7、286.7 ng/mL的基质标准曲线进行重复测定3次。由于实验全程加入同一瓶内标使用液，内标浓度一致，无需考虑内标使用液浓度引入的不确定度，只需考虑内标使用体积引入的不确定度，为方便计算实验将内标TPP质量浓度设为1 ng/mL。即除虫脲与内标TPP质量浓度比值x分别为5.734、11.47、28.67、57.34、114.7、286.7，得到除虫脲与内标TPP定量离子丰度比值y，以x为线性横坐标，y为线性纵坐标，用最小二乘法进行线性拟合，得到标准线性方程y=kx＋b及相关系数R2，结果详见表3。

基质标准曲线拟合的标准偏差：

基质标准曲线拟合的相对标准不确定度：

式中：n为基质标准工作液测定的点数，n=6；p为样品平行测定的个数，p=6；yi为各基质标准工作液浓度对应的响应比值（Ai目标物/Ai内标）；x0为样品测得浓度均值，以回归标准曲线校正所得含量均值计，为97.70 ng/mL（表4）；x¯为标准曲线各点浓度的平均值，为84.10 ng/mL（表3）；b为直线截距，为0.007 3。

表3 基质标曲拟合数据

注：把xi代入直线方程得理论y值，把yi代入直线方程得理论x值。

因此，基质标曲拟合的相对标准不确定度μr(2.2)=0.012。

2.3 茶叶试样前处理产生的不确定度μr（2.3）

试样称量、稀释时产生的不确定度是未知试样前处理过程常见的不确定度。实验全程加入同一瓶内标使用液，内标浓度一致，由于考虑了内标使用体积产生的不确定度，即试样稀释体积不影响到定量结果，实验无需再考虑试样前处理稀释体积引起的不确定度。

2.3.1 茶叶试样称量产生的不确定度μr(m)

检定天平检定证书，其最大允许误差为0.5 mg，已知称样2 g，取矩形分布，则标准不确定度μ(m)=0.289 mg，相对标准不确定度为μr(m)=0.000 1。

2.3.2 茶叶试样加入内标体积产生的不确定μr(v)

前处理过程在茶叶试样中加入0.1 mL内标TPP使用液，根据移液枪检定证书容量允差及温度波动引起的体积变化（表2），相对标准不确定度μr(v)=0.009。

由此，未知试样前处理时产生的相对标准不确定度μr(2.3)：

2.4 茶叶试样测定重复性产生的不确定度μr（2.4）

准确称取6份茶叶试样，经提取、净化步骤，进样分析。试样平行测量结果见表4。

表4 试样测定重复性结果

试样测定均值S¯=0.479 mg/kg（n=6），标准偏差S样品=0.006 2 mg/kg，标准不确定度mg/kg，相对标准不确定度

2.5 茶叶试样加标回收产生的不确定度μr（2.5）

称取阴性基质随行加标，考察回收率产生的不确定度。阴性基质加标回收实验进行6次测定（n=6），除虫脲加标量为114.7 ng，回收率计算结果见表5。

表5 茶叶中除虫脲加标回收率结果

加收率均值S¯=95.2%（n=6），回收率标准偏差S回收=1.4%，标准不确定度相对标准不确定度

使用t检验法检验平均回收率与回收率期望值100%的差异：

查表得，t0.95（5）=2.57＜8.00，显示回收率结果与100%有显著性差异，表明样品测定需要用回收率进行结果校正，校正后的结果为0.503 mg/kg。

2.6 不确定度的合成

除虫脲各分量的相对标准不确定度见表6，则除虫脲的相对合成标准不确定度：

表6 茶叶中除虫脲各分量的相对标准不确定度统计

折算成除虫脲合成标准不确定度为：

2.7 扩展不确定度及结果

在P=95%置信水平，测量结果扩展不确定度取扩展因子k=2，则茶叶中除虫脲残留量测定的扩展不确定度为：U(C)=kμ(C)=0.028 mg/kg。因此，茶叶试样中除虫脲的残留量表示为（0.503±0.028）mg/kg（k=2）。

3 结论与讨论

通过液相色谱-串联质谱法测定茶叶中除虫脲残留量的不确定度，得出该测定方法的扩展不确定度为0.028 mg/kg。从表6可见，称量标准物质及配制基质标准曲线时产生的不确定度μr(2.1)分量对合成不确定度的贡献最大，标准曲线拟合过程产生的不确定度μr(2.2)次之。其中，在合成μr(2.1)众多的小分量中，配制基质标准曲线时引入的不确定度μr(V)，影响最为显著。因此，配制基质标准曲线时使用允差范围小的移液枪，保持恒温恒湿的实验环境，注意操作人员的熟练水平，把控好内标加入体积的重复性，皆有助于减小配制基质标准曲线引入的不确定度。此外，尽可能提高曲线拟合的线性，例如标准曲线每个点测量多次，测量值取平均值进行拟合，线性范围内多取几个浓度点，并确保样品测定结果在曲线范围的中高段等，可降低测定结果的不确定度。